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目的:在威胁人类健康的疾病中,肿瘤尤其是恶性肿瘤越来越多的受到人们广泛关注,因其易侵袭、转移和复发的生物学特性,使得人们在治疗肿瘤的过程中感到十分棘手。而传统的治疗方法显然已不能有效解决肿瘤患者的需求,因此寻找并研发新型高效的治疗方法已迫在眉睫。肿瘤究竟是如何在机体内发生、发展并顺利逃避免疫监视,从而使机体对肿瘤的免疫应答处在一种低能状态,阐明这一机制,无论对于肿瘤发生发展规律的研究还是探索高效的肿瘤治疗方法都有着举足轻重的意义。
PD-L1(programmeddeath1ligand1,程序性死亡受体1配体1)又称B7-H1或者CD274,是近年新发现的B7/CD28家族成员,可在多种免疫细胞和肿瘤细胞上表达,广泛参与自身免疫疾病、移植免疫、慢性感染和肿瘤免疫应答等机体免疫调节过程。研究表明,多种肿瘤组织中PD-L1表达水平的高低,与患者预后等临床病理参数密切相关[1,2]。肿瘤细胞通过高表达PD-L1分子,并与T细胞上的受体PD-1(programmeddeath1,程序性死亡受体1)结合,可传递负性调控信号[3],导致肿瘤抗原特异性CTL(CytotoxicTlymphocytes,细胞毒性T淋巴细胞)凋亡及免疫无能(immuneanergy),从而使肿瘤细胞逃避机体的免疫监控(immunesurveillance)和杀伤。尽管已证实多种肿瘤细胞的胞膜和胞浆都有PD-L1的表达,但肿瘤细胞表面PD-L1调节性表达的机制尚不明确。
B7.1分子同属于B7/CD28家族成员,也被称为CD80,近年来在抗肿瘤研究中受到更广泛的关注,其与CD4+T细胞上的配体CD28/CTLA-4(cytotoxicT-lymphocyteantigen-4,细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4)结合发挥重要的共刺激分子作用,可促进T细胞增殖分化并阻止T细胞凋亡。B7.1在多数肿瘤细胞中往往不表达或仅有低表达,又或仅在细胞内表达而不表达于细胞膜上,从而导致机体不能有效的产生特异性的抗肿瘤免疫应答。同时大量研究表明,采用基因转染方法制备表达B7.1的肿瘤细胞作为肿瘤疫苗[4],均能观察到肿瘤缩小甚至消退等明显抗肿瘤免疫现象,而无B7.1表达的肿瘤细胞通常会诱导机体产生免疫耐受(immunetolerance)。因此,缺乏B7.1共刺激信号被认为是肿瘤细胞得以逃避免疫监视的重要原因之一。
本实验通过构建重组的小鼠pcDNA3/PD-L1及pcDNA3/B7.1真核表达质粒,并分别转染C57BL/6小鼠Lewis肺癌细胞,用G418筛选细胞培养成为稳定转染PD-L1及稳定转染B7.1的肿瘤细胞系。构建小鼠肿瘤模型,通过对比未转染质粒肿瘤细胞与转染质粒肿瘤细胞小鼠的成瘤率及肿瘤重量的差异,初步研究探讨PD-L1及B7.1分子在肿瘤形成过程中对机体免疫应答的影响作用,为日后进一步研究PD-L1分子及B7.1分子的免疫学功能提供实验基础,为肿瘤治疗和基因疫苗的发展提供新的思路和方向。
方法:(1)体外扩增C57BL/6小鼠PD-L1及B7.1DNA片段,与pcDNA3载体连接构成真核表达质粒。
(2)用LipofetamineTM2000将pcDNA3/PD-L1、pcDNA3/B7.1质粒及空载质粒pcDNA3分别转染至C57BL/6小鼠Lewis肺癌细胞,200μg/mlG418筛选稳定生长细胞株,25~30天后降低G418浓度至100μg/ml扩增传代培养稳定转染细胞。用RT-PCR及流式细胞术(FCM)检测稳定转染细胞目的片段表达情况。
(3)6~8周雄性C57BL/6小鼠随机分成A、B、C、D四组,每组10只,分别注射正常Lewis细胞、稳定转染空载质粒pcDNA3的Lewis细胞、PDL1-Lewis细胞及B7.1-Lewis细胞。用无血清的RPMI1640培养基洗细胞三遍,每只小鼠左腹股沟腋下注射5×105细胞/0.2ml。观察各组小鼠成瘤情况、记录出瘤时间,接种后第30天结束实验剥取小鼠肿瘤并对比各组肿瘤重量。
结果:(1)提取NOR-10细胞总RNA,经RT-PCR扩增获得目的DNA片段,经酶切、连接,构建真核表达质粒pcDNA3/PD-L1及pcDNA3/B7.1,酶切鉴定为阳性质粒,基因测序与Genbank中发表的序列(PD-L1:NM-021893.3,B7.1:NM-009855.2)完全一致。
(2)测序正确的pcDNA3/PD-L1、pcDNA3/B7.1质粒及空载质粒pcDNA3体外转染小鼠Lewis肺癌细胞,经G418筛选,获得稳定转染细胞。PDL1-Lewis细胞及B7.1-Lewis细胞经RT-PCR及流式细胞术检测表达PD-L1及B7.1水平均有不同程度的上调。
(3)A组与B组小鼠平均出瘤时间无统计学差异(P>0.05),C组与A组、B组小鼠平均出瘤时间相比均无统计学差异(P>0.05)。D组与A组、B组小鼠平均出瘤时间相比均无统计学差异(P>0.05)。
(4)A、B、C组小鼠成瘤率均为100%,两两比较无统计学差异(P>0.05)。D组成瘤率80%,与A、B组相比均无统计学差异(P>0.05)。
(5)A组与B组小鼠肿瘤重量无统计学差异(P>0.05),C组与A、B组小鼠肿瘤重量相比均无统计学差异(P>0.05),D组小鼠肿瘤重量与A组及B组小鼠肿瘤重量相比均无统计学差异(P>0.05)。
结论:(1)成功构建真核表达质粒pcDNA3/PD-L1及真核表达质粒pcDNA3/B7.1。
(2)建立了稳定表达PD-L1mRNA的Lewis细胞株,以及稳定表达B7.1mRNA的Lewis细胞株。
(3)稳定转染PD-L1的Lewis细胞对小鼠肿瘤形成的作用与正常Lewis细胞相比无明显差异。
(4)稳定转染B7.1的Lewis细胞对小鼠肿瘤形成的作用与正常Lewis细胞相比无明显差异。