第一部分预处理巨噬细胞膜包被金纳米笼治疗细菌感染实验目的:金纳米笼（gold-silver nanocages,GSNCs）在近红外激光的照射下具有光热效应,由此金纳米笼可以作为一种有效的抗菌剂。同时由于金纳米笼具有中空的内部结构和多孔的壁结构,因此该纳米颗粒可以作为抗菌药物的载体。而巨噬细胞膜表面存在细菌识别受体,它与细菌中的病原体相关分子模式之间存在一定的相互作用。由此本实验针对以上两种材料,设计了一种新的靶向传递纳米系统,探究巨噬细胞经特定的细菌处理后,巨噬细胞膜上相应的识别受体表达的变化,并进一步探究预处理的巨噬细胞膜包被金纳米笼构成的纳米系统在体内外对细菌的靶向效果以及抗菌效果。实验一细菌预处理后巨噬细胞的特性方法:将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌与巨噬细胞共培养后,以未处理的巨噬细胞作为空白对照,对细菌处理后的巨噬细胞进行TLR2、TLR4的蛋白免疫荧光染色,流式细胞术检测巨噬细胞膜上受体的表达,RT-PCR检测TLR2、TLR4、TLR6在mRNA水平上的表达。结果:细胞免疫荧光和细胞流式分析显示巨噬细胞膜上TLR2和TLR4的表达升高,RT-PCR结果显示TLR2、TLR4、TLR6在mRNA水平上的表达上调。实验二膜包被金纳米笼的表征、光热行为和药物释放特性方法:通过醇还原、金银置换反应制备金纳米笼颗粒,巨噬细胞膜通过超声破碎、梯度离心获得,将两者混匀后通过机械挤压制备出巨噬细胞膜包被金纳米笼。对此纳米颗粒进行一系列的形态和光热表征,并使用模拟药物进行光控脉冲释放。结果:巨噬细胞膜涂层均匀的覆盖在金纳米笼表面,巨噬细胞膜包被纳米颗粒表现出良好的结构稳定性和蛋白质生物稳定性,并展现出优异的光热转换能力和光热转换稳定性。载药后的金纳米笼能够光响应性的脉冲释放药物。实验三膜包被金纳米笼的体外抗菌效果方法:将不同的巨噬细胞膜包被金纳米笼与金葡菌共同孵育,通过流式细胞术检测巨噬细胞膜包被金纳米笼与细菌的结合能力,并从细菌生长曲线、平板菌落计数和细菌死活染色检验能靶向细菌的纳米颗粒在近红外光照射下的抗菌性能。结果:金葡菌预处理的巨噬细胞膜包被金纳米笼与金葡菌的结合率最高,大肠杆菌预处理的次之。在近红外光照下,金葡菌预处理的巨噬细胞膜包被金纳米笼的抗菌效果最佳。实验四膜包被金纳米笼的体内抗菌效果方法:1.检测静脉注射后不同时间点的血药浓度及器官代谢情况。2.将装载了荧光的巨噬细胞膜包被金纳米笼局部注射于小鼠皮下脓肿部位,通过小动物荧光成像检测纳米颗粒在感染部位的潴留;局部注射于皮下脓肿部位的巨噬细胞膜包被金纳米笼,在近红外光的照射下,通过感染部位的皮损情况、感染组织菌落计数以及温度上升检测其抗菌效果。3.将装载了荧光的巨噬细胞膜包被金纳米笼静脉注射于骨髓炎模型小鼠体内,通过小动物荧光成像检测纳米颗粒在感染部位的聚集;全身注射后的巨噬细胞膜包被金纳米笼,在近红外光的照射下,通过感染组织的菌落计数检测其对感染部位的抗菌效果。结果:1.巨噬细胞膜涂层能够给纳米颗粒通过更长的血液循环时间,主要代谢器官是肝脏和肾脏。2.金葡菌预处理的巨噬细胞膜包被金纳米笼在金葡菌感染的皮下脓肿处存在最大药物潴留,在近红外光照下,金葡菌预处理的巨噬细胞膜包被金纳米笼的在感染处的抗菌效果最佳。3.金葡菌预处理的巨噬细胞膜包被金纳米笼可以特异性靶向至金葡菌感染的骨髓炎处,在近红外光照下,金葡菌预处理的巨噬细胞膜包被金纳米笼的在感染处的抗菌效果最佳。结论:本实验开发的金黄色葡萄球菌预处理巨噬细胞膜包被金纳米笼纳米系统具有明显的细菌粘附性,并在体内表现出延长的血液循环时间和良好的生物相容性,通过局部或全身注射均可有效地传递并保留在感染部位,达到良好的抗菌效果。