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作为一种功能化核酸(FNAs),核酸适配体常常能够弥补抗体的不足或与抗体互补,被广泛应用于新型生物成像的研制中。微纳米材料具有生物相容性好、化学稳定性强等许多优良的特性,使其在生物分析领域展现了新的应用潜力。在本论文中,我们致力于利用微纳米材料的放大和增强功能,将适配体用作靶向探针或用作修饰基底,围绕新型高灵敏的癌细胞生物成像的开发,开展了一系列系统的研究工作。具体包括以下几个部分:
1.利用AS1411来设计对癌细胞的原位免标记荧光成像方法。我们用多功能抗癌适配体(AS1411)和它的荧光配体(PPIX)结合的同时也能特异性结合癌细胞表面的核仁素。AS1411跟PPIX结合形成AS1411-PPIX复合物的同时,能明显加强PPIX的荧光。利用AS1411-PPIX复合物荧光增强机理和AS1411跟癌细胞表面的核仁素特异性结合原理进行癌细胞的成像。为了得到好的荧光成像效应,对体系进行了很多优化,并用荧光、CD、FCM、CLSM进行了表征。实验结果表明,该方法方便、经济,而且能从正常细胞中区分癌细胞。为癌细胞的早期诊断和治疗开拓了新的方向。
2.利用新型四极子保护的银纳米簇来设计癌细胞荧光成像平台。我们设计了水相中合成四极子保护的银纳米簇的方法并且应用到生物成像中。AS1411保护的银纳米簇的量子产率是6.79%。AS1411保护的银纳米簇虽然在水溶液中的荧光比较弱,但是跟核仁素结合进行荧光成像时荧光强度增强。发现AS1411跟核仁素特异性结合,极大增强了银纳米簇的荧光信号。MALDITOFMS的数据显示银纳米簇所含的银原子个数。银纳米簇的比较高抗光漂白现象对癌细胞的早期诊断的生物分析领域里有广泛的潜力。由于四极子保护银纳米簇有良好的生物相容性,这是一种具有更加环境友好的方法。它被成功用来成像和检测癌细胞,表明这种方法在诊断医学上有巨大的实际应用潜力。这些四极子保护的银纳米簇将开拓生物分析领域,甚至有望应用到单分子检测。
3.利用FITC标记的叶酸保护的金纳米粒子(FFANPs)设计生物成像的方法。合成叶酸保护的金纳米粒子时,在HAuCl4/FA碱性体系中,叶酸既是还原剂又是保护剂。FITC是共价连接结合到叶酸保护的金纳米上,得到荧光复合物FFANPs。利用叶酸跟癌细胞表面过分表达的叶酸受体特异性结合原理,用FFANPs孵育癌细胞进行荧光成像。用MALDI-TOFMS表征了叶酸跟FITC的结合,用紫外检测了叶酸保护金纳米的吸收波长,用荧光检测了FFANPs的荧光信号和浓度之间的关系,用高分辨的透射电镜记录了FFANPs的形态,用激光扫描荧光共聚焦显微镜来拍照FFANPs孵育痛细胞的荧光成像,用流式细胞仪检测了FFANPs跟细胞的结合状况。最后用MTT方法检测FFANPs对细胞毒性,发现几乎没有毒性,而且生物相容性比较好。这些结果表明FFANPs成像的方法能应用于不同状态的癌细胞,在癌细胞的早期诊断具有潜在的优势。总之,本方法拥有一些独特的优点,如比较高的灵敏度、简单方便等,并且经济。本工作扩展了叶酸功能化的纳米粒子成像癌细胞的设计思路。同时,该成像方法可以扩展到适配体等技术,具有很大的应用空间。
4.利用NAANPs作为纳米药物设计癌细胞的成像和PDT治疗。我们将NMM作为光灵敏剂,首次报道了利用AS1411作为保护剂合成的NAANPs纳米粒子的新方法。首先,通过混合柠檬酸保护的金纳米粒子和SH-AS1411得到AS1411保护的金纳米粒子。接着在K+存在下,AS1411保护金纳米粒子表面的AS1411形成四极子结合NMM,得到NAANPs纳米粒子。在整个过程中,AS1411先是更换柠檬酸,接着保护金纳米,然后形成四极子结合NMM,最后作为识别探针,特异性结合癌细胞表面的核仁素。NAANPs被引入到癌细胞,用激光共聚焦显微镜进行荧光成像。细胞毒性试验表明,NAANPs本身有较小的毒性,但是光照的条件下,毒性明显加强。这些结果表明该方法在光治疗癌细胞方面有潜在的应用价值。而且,该方法合成和成像比较简单,经济,有望开拓纳米药物在生物分析领域的应用。