论文部分内容阅读
目的:（1）从新疆胀果甘草（Glycyrrhiza inflata）中提取总黄酮,总黄酮中分离纯化天然活性成分甘草查耳酮A和甘草查耳酮B。（2）以甘草查耳酮B为先导化合物,对其进行结构修饰,设计、合成查耳酮类衍生物,并进行结构表征。（3）研究各化合物对人宫颈癌SiHa、HeLa细胞和正常细胞CHO的抑制活性,从中筛选抗宫颈癌活性较强而对正常细胞毒性较低的候选药物。（4）研究候选药物对宫颈癌细胞的促凋亡作用和对细胞周期的影响。（5）预测候选药物与宫颈癌相关蛋白Cyclin-D1、SIRT1、CDK4和MDM2的结合强度与结合方式,并测定候选药物对此蛋白表达水平的影响。方法:（1）以超声辅助乙醇提取法提取得到胀果甘草粗提物,并通过聚酰胺和AB-8大孔树脂纯化总黄酮,通过制备薄层色谱结合硅胶柱层析法分离纯化甘草查耳酮A和甘草查耳酮B。（2）以取代苯乙酮和取代苯甲醛为原料,经Claisen-Schmidt碱催化方法合成查耳酮类衍生物,有机溶剂加水重结晶的新技术分离纯化得到目标化合物,化合物的结构特征经1H-NMR和13C-NMR表征。（3）通过MTT法,以顺铂为阳性对照,测定各化合物对人宫颈癌SiHa和HeLa细胞增殖的抑制活性及对中国仓鼠正常卵巢细胞CHO的毒性,并用SPSS21.0求出IC50值,根据活性和毒性数据确定候选药物。（4）采用流式细胞仪法测定候选药物对SiHa和HeLa细胞的促凋亡作用和细胞周期的影响。（5）运用计算机辅助分子对接法预测候选药物和Cyclin-D1、SIRT1、CDK4及MDM2蛋白的结合方式,并用ELISA法测定候选药物对SiHa细胞中Cyclin-D1、SIRT1、CDK4及MDM2蛋白含量的影响。结果:（1）胀果甘草乙醇提取物出膏率为21.4%,粗提物中黄酮含量17.98%,纯化后总黄酮含量57.96%,比纯化前提高了40%。（2）合成了24个查耳酮类衍生物,经TLC检测和结构鉴定确定均为纯度较高的目标化合物,产率在10.391.7%之间。（3）SiHa、HeLa和CHO三种细胞的MTT结果显示26个化合物在0100μg/mL的浓度范围内对三种细胞均有不同程度的抑制作用,且抑制率与给药剂量和干预时间呈正相关。其中结构修饰后的19个化合物对SiHa和HeLa的抑制活性均高于先导化合物lico B,尤其化合物21（2,3,4-三甲氧基-3′,4′-二甲氧基查耳酮）干预SiHa和HeLa24 h的IC50分别为9.66和5.64μg/mL,活性高于先导化合物11倍,而对CHO的IC50是74.36μg/mL,即对正常细胞毒性低。（4）流式细胞实验结果显示Lico A、化合物17和化合物21均有显著的促凋亡作用,其中凋亡率化合物21>化合物17>Lico A,周期结果显示候选药物将细胞周期阻滞在G2/M期。（5）分子对接和ELISA结果显示LicoB、LicoA、化合物17和化合物21与Cyclin-D1、SIRT1、CDK4及MDM2有较显著的结合能力,并在不同程度上下调宫颈癌细胞信号通路中的这四种蛋白的含量。结论:甘草查耳酮B的甲氧基化修饰显著提高其衍生物的抗宫颈癌活性,且通过诱导宫颈癌细胞凋亡和将细胞周期阻滞在G2/M期而发挥抗宫颈癌作用。同时,本研究发现甘草查耳酮类化合物还能下调宫颈癌SiHa细胞信号通路中的Cyclin-D1、SIRT1、CDK4及MDM2的含量,从而抑制抑癌基因p53和pRb的降解而发挥抗宫颈癌作用。