研究背景骨肉瘤是一种好发于青少年最常见的原发性恶性骨肿瘤,其突出的特点是转移早,在临床做出诊断时,已经有80%的患者发生了肺部转移。近几十年以来,骨肉瘤的治疗有了长足的进展,近80%的患者能够保留患肢,而且5年生存率由20%提高到80%,但是仍有半数以上的患者死于骨肉瘤的复发和转移。对于骨肉瘤的治疗仍然有许多的难点和疑点,因此需要探索更有效、更低毒性的治疗途径。近十年来肿瘤的基因治疗、免疫治疗和分子靶向治疗已经成为当前临床骨肉瘤研究的热点,探索新的、更加有效的治疗方法已经成为了骨肉瘤研究的重要方向。在此我们描述一个由HER2抗原特异性e23sFV单链抗体、一个单链Pseudomonas exotoxin A和一个能够直接劈裂核纤层蛋白A(lamin A)导致细胞发生程序性死亡的活性caspase-6所组成的immunocasp-6融合基因所执行的实验。人表皮生长因子受体2(HER2),属于表皮生长因子受体家簇成员之一,在细胞信号转导过程中发挥重要作用,是细胞生长、分化以及存活的重要调节者。充足的证据已经表明HER2抗原过度表达的肿瘤患者对传统的治疗呈现一个比较差的预后。HER2抗原已经被报道在人类好几种恶性肿瘤细胞表面过度表达,包括人乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌和骨肉瘤。因为其在恶性肿瘤细胞表面过度表达而在正常细胞表面很少表达或者不表达,因此在分子水平上探索正常细胞和恶性肿瘤细胞差异性上HER2抗原已经成为了一个理想的基因治疗的靶向性分子。Caspases是哺乳动物传导凋亡信号和导致细胞发生凋亡的主要成分,在细胞发生程序性凋亡的过程中Caspase-6是最有效的效应Caspases之一,活性Caspase-6通过劈裂底物核纤层蛋白A (lam in A)以及其他亚基来引导凋亡的发生。跟野生型的酶原衍生物不一样,活性的Caspase-6由顺序相反的两个亚基组成,能够在体外独立地自动地传导凋亡信号,诱导细胞发生凋亡,这一特点使得活性Caspase-6成为基因治疗过程中非常有潜力的效应分子。Pseudomonas exotoxin A (PEA)是由三个大的结构域(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)所组成的单链毒素,结构域Ⅰ负责将分子结合到靶细胞,结构域Ⅱ负责把分子转位到胞质,结构域Ⅲ负责导致细胞发生死亡。PEA的结构域Ⅱ已经被报道能够高效地将细胞的毒性结构域转位到细胞质。用活性的Caspase-6替代PEA的结构域Ⅲ,我们旨在将效应Caspase易位至肿瘤细胞质中,让它诱导肿瘤细胞发生凋亡。作为一个被公认的抗体,e23sFV单链抗体起源于鼠抗人HER2单克隆抗体,被确认对HER2细胞外区域有高度亲和性,并且能够通过细胞的胞吞作用而内入细胞。抗原抗体反应的高度特异性暗示着我们所构建的immunocasp-6融合基因中的e23sFV单链抗体能够特异性地识别过度表达的恶性肿瘤细胞表面的HER2抗原,在PE结构域Ⅱ的介导下将immunocasp-6融合基因转位至肿瘤细胞质中,由活性Caspase-6劈裂底物核纤层蛋白A (lamin A)以及其他亚基来引导凋亡的发生,从而特异、高效性抑制HER2抗原过度表达的恶性肿瘤。虽然这一新奇的immunocasp-6融合基因已经被证明能够特异、高效性诱导HER2抗原过度表达的人乳腺癌SKBR3细胞发生凋亡,但是是否能够特异、高效性诱导人骨肉瘤细胞发生凋亡仍然不清楚。因此本研究的目的是延伸immunocasp-6融合基因的对HER2抗原过表达恶性肿瘤的治疗策略,在体外、体内试验中验证immunocasp-6融合基因对HER2抗原过度表达骨肉瘤的特异、高效性抑瘤效果。材料与方法质粒和DNA构建我们通过序列融合信号肽基因(Met-Lys-His-Leu-Trp-Phe-Phe-Leu-Leu-Leu-Val-Ala-Ala-Pro-Arg-Trp-Val-Leu-Ser-)构建了一个重组型的immunocasp-6融合基因(由PE结构域Ⅱ的NH2终末端融合抗HER2抗原的单链抗体(e23sFv)以及PE结构域Ⅱ的COOH终末端融合重组Caspase-6所构成图2-2)。Immunocasp-6融合基因然后被克隆入pCMV质粒中,构建成pCM V-immunocasp-6。细胞培养人骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞系具有高度远处转移潜力,它来自一个17岁的男性病人,他被诊断为胫骨骨肉瘤,并且接受了截肢手术,并在体外经过1年时间、连续120代传种接代所建立的骨肉瘤细胞系。骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞被保存于DMEM or RPMI-1640(Invitrogen)细胞培养基中生长,这些培养基不断补充10%胎牛血清(FBS)和4mmol/1的L-谷氨酰胺。骨肉瘤细胞表面HER2抗原的检测待骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞生长至一定数目后,以鼠抗人HER2单抗作为一抗,按标准程序进行间接免疫荧光染色检测以及流式细胞术检测；骨肉瘤组织来自于全军骨肿瘤研究82例骨肉瘤患者,肿瘤组织用多聚甲醛固定制作成石蜡切片,进行HER2抗原的SP法免疫组织化学染色,具体操作过程参照Vectastain Elite ABC kit试剂盒操作说明每一个步骤进行,处理完后用Olympus Eclipse E600显微镜照相并行图像处理。细胞的瞬时转染转染前24小时,骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞以1×105或5×105/孔种植于96或12孑costar transwell平板中,lug pCMV-immunocasp-6或pCMV空载体与2ul Lipofectamine2000(Invitrogen)混合,室温下孵育20分钟形成DNA-liposome混合物,接下来混合物接种于骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞中,并在湿润孵化器37℃、5%CO2条件下继续孵育6h,然后培养基被移去,细胞被重新悬浮生长在完全培养基中。细胞生存能力分析瞬时转染的肿瘤细胞的生存能力通过3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazo-lium bromide (MTT)方法检测。简单来说,等骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞粘附到96孔costar transwell平板底时完全随机分为三组,即正常细胞组,pCMV空载体治疗组及pCMV-immunocasp-6治疗组。用阳离子脂质体包裹pCMV-immunocasp-6或是pCMV空载体按照上述方法进行转染。转染后的骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞继续在96孔costar transwell平板内培养12-96小时,分别于转染以后的不同时间点(12、24、36、48、60、72、84、96h)吸弃培养液,于每孔内加入20ml1.5mg/ml MTT液后继续孵育4h,此后,骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞用150μl DMSO溶液处理,TECAN光吸收酶标仪上测定各孔490nm波长光密度值。每个试验都在至少三个独立的场合进行了三次检测。流式细胞术检测细胞的凋亡骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞以1×05/孔密度接种于装有载玻片的12孔costar transwell平板上,当骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞生长至3×105/孔时用阳离子脂质体包裹pCMV-immunocasp-6或pCMV空载体按照上述方法进行瞬时转染,转染后的第48小时收集载玻片上的细胞,具体操作方法按照标准程序进行Annexin V-FITC/PI染色,并最后用流式细胞仪进行分析。免疫荧光检测骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞转染后在完全培养基中继续培养48小时,待细胞爬片以后以40g/L多聚甲醛固定,用含有0.1%Triton X-100PBS溶液进行透化处理,接着以30ml/L H2O2灭活内源性过氧化物酶,再以二抗同源的正常动物血清进行封闭,依次加入一抗、荧光二抗、DAPI染核,封片后直接以荧光显微镜观察并照相。电子显微镜分析骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞转染48h后用2.5g/L的胰酶消化成为单个细胞,离心收集细胞,用2%戊二醛4m1在4℃固定30min-2h,依次用不同浓度的丙酮溶液进行脱水,用明胶囊包埋,制备成半薄切片、超薄切片,加入醋酸双氧铀染色液染色,透射电镜观察并照相。免疫细胞化学技术检测骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞转染后按上述方法在载玻片上继续培养,到适当数量后用新鲜准备的多聚甲醛溶液在室温下固定30分钟,用0.1%Triton X-100在冰上通透15分钟。样本用山羊抗人Caspase-6多抗作为第一抗体(C20,1:200; Santa Cruz Biotechnologies)检测,生物相关的抗兔抗体IgG(1:100; Santa Cruz Biotechnology)作为第二抗体,然后遵照Vectastain Elite ABCkit试剂盒操作说明每一个步骤进行,处理完后用Olympus Eclipse E600显微镜照相并行图像处理。Immunocasp-6难体内抗肿瘤活性6-8周BALB/C裸鼠购自国际啮齿类实验室动物资源部上海分公司,饲养和使用遵照机构的指南。裸鼠皮下接种2×106骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞,待肿瘤自由生长至直径5-7mm大小时,裸鼠被完全随机分为两组：pCMV-immunocasp-6治疗组或pCMV空载体治疗组。荷骨肉瘤SOSP-9607-E10肿瘤的裸鼠分别于右后肢肌肉注射脂质体包裹的pCMV-immunocasp-6或pCMV空载体(pCMV-immunocasp-6或pCMV空载体与脂质体按10ug：20u1比例进行混合),每组使用9只裸鼠,每只裸鼠每隔3天注射一次,共5次,观测肿瘤的体积、裸鼠的重量,2周后处死全部裸鼠,仔细剥离裸鼠身上肿瘤,并记录肿瘤的纯重量,所有数据(肿瘤的体积、裸鼠的重量以及肿瘤的纯重量)采用统计学软件进行分析。HE(苏木精-伊红)染色裸鼠处死后肿瘤组织用多聚甲醛固定制作成石蜡切片,在进行染色前对石蜡切片脱蜡至水,用苏木精染色10min,然后用水冲洗,在盐酸酒精中浸泡10min,用流水冲洗,逐渐脱水,用伊红染色5min,脱水至透明,封片后用倒置显微镜观察并照相。TUNEL染色裸鼠处死后肿瘤组织用多聚甲醛固定制作成石蜡切片,石蜡切片经脱蜡、透明、水化后,具体步骤按试剂盒TdT-FragELTM DNA Fragmentation说明书进行操作,并用苏木精进行复染色。免疫组织化学技术检测裸鼠处死后肿瘤组织用多聚甲醛固定制作成石蜡切片,组织切片经脱蜡、水化后,用0.3%甲醇-H202孵育20分钟去掉内源性过氧化物酶,接着烘干这些组织,用适当的血清在湿化箱内阻断1小时,添加一抗4℃过夜。样本用山羊抗人Caspase-6多抗作为第一抗体(C20,1:200; Santa Cruz Biotechnologies)检测,生物相关的抗兔抗体IgG (1:100; Santa Cruz Biotechnology)作为第二抗体,然后遵照Vectastain Elite ABC kit试剂盒操作说明每一个步骤进行,处理完后用Olympus Eclipse E600显微镜照相并行图像处理。评价immunocasp-6对人骨肉瘤肺部转移的影响18只6-8周BALB/C裸鼠购自国际啮齿类实验室动物资源部上海分公司,饲养和使用遵照机构的指南。于胫骨骨髓腔接种2×105骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞,裸鼠随后完全随机分为两组,9只裸鼠为一组,分别按上述方法于裸鼠右后肢肌肉注射脂质体包裹的pCMV-immuno casp-6或pCMV空载体(pCMV-immunocasp-6或pCMV空载体与脂质体按10ug：20u1比例进行混合),前两周每3天一次,其后每周一次,共5周,让裸鼠自然死亡,记录裸鼠的生存期,裸鼠死亡后肺内肿瘤新生物解剖出来后计数并进行HE(苏木精-伊红)染色诊断。统计分析所有数据以均数±标准差的形势表达,数据结果采用SPSS13.0统计软件(SPSS, Chicago, IL)进行处理,细胞活力采用方差分析(ANCOVA, dunnett T3),肿瘤的体积、裸鼠的重量及肿瘤的纯重量采用两个独立样本t检验(肿瘤的体积、裸鼠的重量数值为治疗前后差值)分析,生存曲线采用Kaplan-Meier method分析,治疗组之间的比较通过对数秩和检验(Log-rank)法得到。统计学意义是基于P<0.05的值。结果Immunocasp-6融合基因在体外实验中能够特异、高效性抑制骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞生长XU等人已经研究证明immunocasp-6融合基因能够特异性识别HER2抗原过度表达的乳腺癌细胞,内化进入细胞后,在PEA Arg279and Gly280之间进行自动切割作用,由caspase-6诱导肿瘤细胞发生凋亡,而对HER2抗原不表达的细胞无杀伤作用。为了研究pCMV-immunocasp-6能否在HER2抗原过度表达的骨肉瘤细胞上发挥同样的促凋亡的效果,我们先通过3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazo-lium bromide (MTT)法验证骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞瞬时转染后细胞的生存活力,研究结果表明瞬时表达的immunocasp-6融合基因能够导致细胞生存活力明显降低,pCMV-immunocasp-6治疗组肿瘤细胞的生存活力比正常组、pCMV空载体治疗组差pCMV-immunocasp-6治疗组肿瘤细胞与正常细胞组之间有统计学意义差别(P=0.013), pCMV-immunocasp-6治疗组肿瘤细胞与pCMV空载体治疗组之间有统计学意义差别(P=0.007),而正常细胞组肿瘤细胞与pCMV空载体治疗组之间没有统计学意义差别(P=0.989)。骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞瞬时转染后第48小时进行Annexin V-FITC染色检测显示pCMV-immunocasp-6组的细胞凋亡率为31.4%,而pCMV空载体组的细胞凋亡率为6%。在pCMV-immunocasp-6组肿瘤细胞转染后生长缓慢的同时,我们对转染后的肿瘤细胞形态学变化进行了测试。免疫荧光染色检测发现pCMV-immunocasp-6组肿瘤细胞出现核浓缩,核碎裂；透射电子显微镜发现pCMV-immunocasp-6组肿瘤细胞呈现典型的凋亡现象,包括染色体凝聚,异染色体边集,细胞核浓缩,出泡,形成所谓的凋亡小体；而且,免疫细胞化学染色检测进一步显示凋亡细胞中大部分Caspase-6的表达,暗示着Caspase-6在导致细胞发生凋亡的过程中发挥了积极作用。Immunocasp-6融合基因在体内实验中能够特异、高效性抑制骨肉瘤生长在脂质体包裹的pCMV-immunocasp-6治疗组中,骨肉瘤的生长明显慢于脂质体包裹的pCMV空载体治疗组,它们之间有统计学意义差别(t=3.177,P=0.006),pCMV-immunocasp-6治疗组中裸鼠的体重明显重于pCMV空载体治疗组,它们之间有统计学意义差别(t=-5.153, P=0.001), pCMV-immunocasp-6治疗组中肿瘤的纯重量明显轻于pCMV空载体治疗组,它们之间有统计学意义差别(t=5.407,P=0.001),接着裸鼠处死后的肿瘤组织收集进行HE(苏木精-伊红)染色,HE(苏木精-伊红)染色结果表明pCMV-immunocasp-6治疗组肿瘤组织呈现比较差的生长条件,大部分细胞死亡,而pCMV空载体治疗组肿瘤组织细胞生长良好。末端脱氧核糖核苷酸转移酶标记技术(TUNEL)进一步证明pCMV-immunocasp-6治疗组中肿瘤组织中大多细胞呈现凋亡的状况,而pCMV空载体治疗组肿瘤组织细胞生长良好。此后,免疫组织化学染色在pCMV-immunocasp-6治疗组中证实了肿瘤组织中Caspase-6的表达,而在pCMV空载体治疗组和肌肉组织(不管是pCMV-immunocasp-6治疗组还是pCMV空载体治疗组)中均未见Caspase-6的表达。这些数据暗示着immunocasp-6在体内能够特异、高效地促使HER2抗原过度表达的骨肉瘤细胞凋亡。Immunocasp-6在体内实验中对HER2过度表达的骨肉瘤肺部转移的抑制作用待裸鼠自然死亡后,解剖裸鼠肺部的新生物,进行HE(苏木精-伊红)染色诊断结果证明为骨肉瘤。在pCMV-immunocasp-6治疗组中肺内新生物的数目明显少于pCMV空载体治疗组。与此同时,pCMV-immunocasp-6治疗组裸鼠的生存期明显长于pCMV空载体治疗组。在缺乏immunocasp-6融合基因治疗作用的前提下,骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞有更高的肺转移可能,暗示着immunocasp-6能够阻止骨肉瘤肺部转移的发生。结论体外、体内实验结果表明：immunocasp-6能够特异、高效性识别、结合骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞表面的HER2抗原,被内吞入细胞后,对细胞底物进行识别切割,执行促使细胞发生凋亡的功能,而对于HER2不表达或者低表达的组织无明显杀伤与损伤作用。从此可以看出,我们所构建的immunocasp-6融合基因中e23sFv单链抗体仍然保持了其对HER2过度表达肿瘤细胞的靶向性识别与结合能力,与此同时与抗体融合以后的重组型Caspase-6的促凋亡活性也未受到影响。与一般所构建的免疫毒素分子不同,Caspase-6是细胞凋亡途径过程中共同的末端效应蛋白酶,是细胞发生凋亡的直接执行者,所以,我们所构建的融合基因必然能够更加高效性促进HER2过度表达的肿瘤细胞发生凋亡而且不会杀伤正常无辜的细胞。此外,由于immunocasp-6融合基因主要是由人源化抗体e23scFv以及人类自身的蛋白Caspase-6分子构成,其免疫原性低,能够反复使用,由此建立了一种持续、特异、高效、安全的治疗方法,为HER2过度表达的骨肉瘤治疗治疗提供基础。