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纤维素酶在食品、能源、纺织等诸多行业有着广泛的应用,但天然纤维素酶降解纤维素的效率低,不能满足工业化生产的需要。进行纤维素酶的改造以提高酶活性的研究有着显著的理论意义和重要的应用价值。
本研究进行了构建人工多结构域纤维素酶的探索。采用基因融合的方法把内切-β-葡萄糖苷酶基因eg2的3’端连接在纤维二糖水解酶Ⅱ基因cbh2的5’端形成融合基因elc,该融合基因在巴氏毕赤酵母(PichaPastoris)GSll5中成功表达。
cbh2、eg2均来自里氏木霉(Trichoderma reesei)。用常规PCR方法从里氏木霉菌株QM9414中扩增出纤维二糖水解酶Ⅱ基因cbh2以及eg2基因的两个外显子E1、E2和连接肽(linker)。通过重叠PCR将E1、E2、linker、cbh2的上游基因片段Cl拼接在一起形成融合基因elCl(eg2-linker-Cl)。利用酶切位点将elCl、cbh2的下游基因片段C2插入到巴氏毕赤酵母的表达载体pPICZaA中,并使之处于仅一因子信号肽序列的下游,得到重组质粒pPICZaA-elc(eg2-linket-cbh2)。
用线性化的pPICZaA-elc通过电穿孔的方法转化巴氏毕赤酵母GS115菌株,筛选后得到含有多拷贝融合基因毕赤酵母菌株Pichia-ELC。在甲醇诱导的条件下Pichia-ELC培养液中的滤纸酶活达到6.0 IU/ml(出发菌株滤纸酶活性非常微弱)。融合基因所表达的蛋白分子量约120kD。
进行了融合基因elc在里氏木霉QM9414中的同源表达。将融合基因elc和质粒pAN7-1共转化QM9414原生质体,在含有潮霉素的PDA平板上筛选阳性转化子并进行PCR验证,将转化子接种于液体诱导培养基中培养。转化子滤纸酶活较原菌株QM9414有所提高。