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副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)是正常猪群上呼吸道的一种常见的共生菌,但在特定的条件下可以侵入机体,并引发以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎等为主要特征的疾病,该病又被称为革拉瑟氏病(Glasser’s disease)。最近副猪嗜血杆菌病已经成为猪场保育仔猪死亡的一个主要原因,但是引起其致病的原因仍然还不是很清楚。HPS常在健康猪的鼻腔、扁桃体、气管中分离到,因此区分出正常栖生菌株与致病性菌株是确诊该病的关键所在。毒力因子是区分致病与非致病菌株的重要标志物,目前,副猪嗜血杆菌的毒力因子尚未被阐明。蛋白质是生命体发挥生物学功能的真正载体,因此在蛋白质水平研究副猪嗜血杆菌的毒力因子将为建立区分致病性生菌株和非致病性菌株的鉴别诊断方法及致病机理提供了新的线索。本研究针对副猪嗜血杆菌临床分离株血清13型14A7-2和血清不定型20A3-2开展差异蛋白研究。根据其引起的临床症状、潜在毒力基因检测和动物感染实验的结果,确定14A7-2和20A3-2菌株分别为毒力菌株和非毒力菌株。提取14A7-2菌株和20A3-2菌株的菌体蛋白,优化HPS菌体蛋白双向电泳条件,确立最佳pH范围、胶条长度、聚焦时间和上样量等,成功地建立了分辨率高和重复性好的HPS菌体蛋白的2-DE图谱。通过Imagemaster2D Platinum7.0软件分析两个菌株之间2-DE图谱差异和MALDI-TOF/MS质谱鉴定差异蛋白。在副猪嗜血杆菌毒力菌株中检测到596±10个蛋白质点而在非毒力菌株中检测到568±10个蛋白点,其中毒力菌株或非毒力菌株特有的蛋白点以及表达量差异达5倍以上蛋白点共有80个。选取毒力菌株或非毒力菌株特有的44个差异蛋白点进行质谱鉴定,成功鉴定42个蛋白点,对应37种蛋白。其中,毒力菌株特有蛋白27种,非毒力菌株特有蛋白5种。在毒力菌株特有蛋白中鉴定出潜在毒力因子铁摄取调节蛋白、触发因子、3-脱氢奎尼酸脱水酶等。鉴定出的这些差异蛋白为进一步研究HPS的毒力因子提供信息。根据本2-DE实验已鉴定的差异蛋白,从中选取毒力菌株特有的差异蛋白铁摄取调节蛋白(ferric uptake regulation protein)和3-脱氢奎尼酸脱水酶(3-dehydroquinate dehydratase)及非毒力菌株特有的差异蛋白精氨酸ABC转运子(arginine ABC transporter, substrate-binding protein)进行进一步的差异性验证。分别以14A7-2和20A3-2菌株基因组DNA为模板PCR扩增相应基因,定向克隆到表达载体PET-28a (+)中,并表达和提纯蛋白,免疫小鼠制备抗血清,再以Western-blotting技术进行验证。结果表明铁摄取调节蛋白和3-脱氢奎尼酸脱水酶在毒力菌株14A7-2中的表达量明显高于其在非毒力菌株20A3-2中的表达量；精氨酸ABC转运子在非毒力菌株20A3-2中的表达量明显高于其在毒力菌株14A7-2中的表达量,它们可能是副猪嗜血杆菌的毒力因子。这为HPS毒力因子的寻找及其致病机理的研究提供一定的基础。