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本论文用三维杂核核磁共振波谱技术以及计算机分子模拟与显示技术完成了基质金属蛋白酶—12(MMP-12)与γ-keto butanolic acid类抑制剂复合物的溶液三维结构研究。
基质金属蛋白酶—12，也称作金属弹性蛋白酶，是基质金属蛋白酶家族的重要成员之一。基质金属蛋白酶是一族维持机体组织细胞外基质正常生理结构和功能所必须的金属锌离子依赖性的水解蛋白酶。MMP-12主要是在巨噬细胞内表达的，其水解弹性蛋白的比活力在基质金属蛋白酶家族中最高。金属弹性蛋白酶与人类的疾病密切相关，这些疾病包括高致死率的动脉血管粥样硬化、慢性阻塞性肺疾病和肺气肿。
我们首先构建了MMP-12催化结构域在pETllc中的高水平表达体系。完成了MMP-12在大肠杆菌中的表达、分离、纯化及蛋白包含体的变性与复性。通过检测MMP-12对荧光底物(FP)的切割活性证实复性好的蛋白具有很好的酶活性。在此基础上，制备了符合三维核磁共振研究要求的13C、15N同位素标记的蛋白样品。1H-15N HSQC核磁共振谱图中相关峰的良好的分散性分布证明复性后的蛋白结构折叠正确。
在获得了同位素标记的蛋白样品后，开展了一系列的二维和杂核三维实验研究。通过HNCA、HNCOCA、HNCACB和CBCACONH等三维实验完成了MMP-12的主链的核磁共振信号的归属。在主链归属的前提下，分析TOCSY-NHSQC、HCCONH、及重水中的HCCH-TOCSY、HCCH-COSY谱图，完成了MMP-12的侧链信号的归属。最终对15N-editedNOESY和13C-editedNOESY的谱图的分析，完成了NOE的信号归属。
在完成了NOE的信号归属的基础上，我们对MMP-12与γ-keto butanolic acid抑制剂复合物进行溶液结构计算。通过距离约束、氢键约束和扭转角约束进行分子动力学与模拟退火计算，并结合计算机分子模拟与显示技术，得到了一组最优构象来代表MMP-12与小分子配体复合物的溶液三维结构。最优构象分子的骨架原子RMSD值为1.28±0.25(A)，重原子为1.83±0.76(A)。而在二级结构区域则降至0.37±0.15(A)和1.56±0.23(A)。Ramachandran图分析可知，MMP-12的20个最优构象的φ角和Ψ角分布大部分都处于可接受的区域。在最好的区域占69.7％，次好的区域占22.1％，允许的区域占6.2％，不好的区域只占2.0％。MMP-12的整体折叠与所有已知MMP家族成员类似，由三股α-螺旋结构(hA：Arg127-Asn143，hB：Leu212-Ser223，hC：Asp254-Ser260)，四股平行的β-链(sⅠ：Tyr113-Ile118，sⅡ：Lys148-Lys151，sⅢ：Ile159-Ala164和sⅤ：Ala195-Asp198)和一股反平行的β-链(sⅣ：Ala182-Ala184)形成的β-折叠片结构，以及连接规则二级结构之间的loop所组成的三维结构。
论文最后讨论了金属离子配位作用、氢键相互作用及疏水相互作用在稳定MMP-12的三维结构中发挥了重要的作用。阐述了MMP-12的活性口袋及其与配体的相互作用模式及配体分子与MMP-12作用选择性和特异性的结构因素。
在MMP12与小分子抑制剂复合物的溶液结构中，位于α-螺旋hB上的残基Leu214、Thr215、His218、选择性loop上的Pro238-Thr239-Tyr240的主链原子及残基Tyr240的侧链共同构筑了S1活性位点的口袋口。选择性loop上的疏水性残基Va1235、Phe237、Thr239、Lys241、Val243的侧链则构筑了S1活性口袋的外壁。小分子抑制剂的P1’基团比较完满地充盈了S1’活性口袋，与其口袋侧壁的疏水残基形成了较强的疏水亲脂相互作用。同时P1基团上的两个苯环也与组成S1’活性口袋上的芳香性残基形成π—π的相互作用。抑制剂中的羧基没有与催化活性中心的Zn2+配位，而是与Ala182残基的酰胺氢形成氢键。
S1’活性口袋的大小、及组成活性口袋残基的性质决定了配体分子与MMP-12作用选择性和特异性的结构因素。MMP-12的S1’活性口袋较为疏水性的，并略带碱性。位于S1’活性口袋口的215-位的残基在一定程度上影响了P1基团作为探针对S1’活性口袋的探索。MMP-12这一位置的残基是一个亲水性的Thr残基，而其它MMP这一位置大多数是疏水性的Val残基，这也是配体分子与MMP-12作用选择性和特异性的一个重要结构特征。
总之，MMP-12在动脉血管粥样硬化、慢性阻塞性肺疾病中起着很重要的作用，作为体内很重要的一个药物靶点，研究MMP-12与小分子配体γ-keto butanolic acid类抑制剂复合物的溶液三维结构，解析其活性口袋的精细结构和性质及其与小分子配体结合的分子机理对寻找或设计高亲和性，高选择性小分子配体具有很重要的意义。