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颞下颌关节骨关节炎（Temporomandibular joint osteoarthritis,TMJ OA）是颞下颌关节紊乱病的重症表现,TMJ髁突软骨下骨异常改建是其主要病理表现之一。异常负荷是TMJ OA主要病因之一,课题组建立的单侧前牙反合（Unilateral anterior crossbite,UAC）小鼠模型很好地模拟了TMJ OA发生发展的过程,并且这一过程是可逆的,在去除UAC不良咬合刺激后OA样变会明显改善,为研究TMJ OA中软骨下骨病理改建及其转归过程中的细胞与分子活动提供了有力的动物模型基础。骨髓脂肪组织（Bone marrow adipose tissue,BMAT）是骨髓腔内的重要组成部分,占人体脂肪总量的10%;随着年龄增长,BMAT还会逐渐增加,在人类25岁时其体积可达骨髓腔体积的70%。在许多生理或病理性改变中,BMAT和骨矿物密度呈现出此消彼长的关系。OA早期小梁骨吸收明显,以往研究表明,成骨细胞和破骨细胞活性的平衡是维持骨稳态的关键因素,而在髓腔中大量存在的骨髓脂肪细胞（Bone marrow adipocytes,BMAds）的作用尚待明确。BMAds是BMAT中主要的细胞成分,与成骨细胞相同,均由骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）分化而来。来源于同一祖细胞的各种终末分化的细胞之间在一定条件下可相互转化,BMAds和成骨细胞是否存在转分化,并且这种可能存在的转分化活动在OA骨改建中的表现及内在的分子机理值得深入探究。细胞外基质硬度特性可明显影响细胞命运选择,Piezo1是机械敏感性离子通道,可以感受细胞外基质硬度环境的变化,并影响细胞分化状态。Piezo1及下游信号通路是否参与了软骨下骨改建过程,以及在BMAds和成骨细胞之间可能存在的相互转化过程中是否发挥着关键分子作用,值得深入探讨。本课题围绕TMJ软骨下骨改建过程中,Lep R+来源细胞成骨分化及成脂分化活动特点、BMAds和成骨细胞转分化关系以及Piezo1及其下游分子通路在BMAds和成骨细胞转分化过程中的关键分子作用展开了以下研究。（一）异常咬合刺激导致Lep R+来源细胞成骨分化和成脂分化方向改变的实验研究【研究方法】1、构建UAC模型及UAC刺激后去冠（UAC-RE）模型,利用组织形态学及Micro-CT检测确认模型中TMJ髁突软骨下骨组织学改变;通过q RT-PCR探究成骨和成脂相关基因表达的变化。2、利用表达瘦素受体（Leptin receptor,Lep R）的细胞被Td T特异性标记的转基因动物(Td TLep R),并施加UAC刺激,通过荧光染色分析Td TLep R+细胞的分化状态;流式分选出Td TLep R+细胞,进行体外诱导分化及相关干预实验,通过q RT-PCR及细胞染色的方法探究影响其分化方向的因素。【研究结果】1、与同龄对照组相比,UAC小鼠TMJ髁突软骨下骨中髓腔面积增大、骨体积分数（Ratio of bone volume to tissue volume,BV/TV）和骨小梁厚度（Trabecular thickness,Tb.Th）降低,骨小梁分离度（Trabecular separation,Tb.Sp）升高;成脂分化标志物过氧化物酶体增殖物活化受体γ（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ）、脂肪酸结合蛋白4（Fatty acid binding protein 4,FABP4）及脂联素（Adipo Q）m RNA表达水平明显增高,而成骨分化特异性分子锌指结构转录因子（Osterix,OSX）、骨钙素（Osteocalcin,OCN）及牙本质基质酸性磷酸蛋白1（Dentin matrix acidic phosphoprotein 1,DMP1）m RNA表达降低;以上改变在UAC-RE组出现明显逆转。2、UAC刺激导致TMJ髁突软骨下骨中Td TLep R+细胞数量显著减少,Td T-OSX或Td T-OCN双标细胞百分比明显降低,Td T-BODIPY脂滴荧光染色双标细胞或Td T-Adipo Q免疫荧光染色双标细胞百分比显著升高,同时瘦素（Leptin）表达减少。外源性补充Leptin可升高UAC小鼠BV/TV和Tb.Th并降低Tb.Sp;q RT-PCR结果显示,成脂分化标志物Pparg、Fabp4及Adipoq的m RNA表达水平明显降低,而成骨分化特异性分子Osx、Ocn及Dmp1的m RNA表达水平升高;Td TLep R+细胞数量明显增加,Td T-OSX或Td T-OCN双标细胞的百分比明显升高,Td T-BODIPY或Td T-Adipo Q双标细胞的百分比显著降低。3、流式分选出Td TLep R+细胞,在体外诱导分化的同时外源性添加Leptin;结果表明,在较低水平Leptin时,油红O染色可呈现较多脂滴,成脂分化分子标志物Pparg、CCAAT/增强子结合蛋白α（CCAAT/enhancer binding proteinα,Cebpa）、Fabp4及Adipoq的m RNA表达水平较高;而在较高水平Leptin时,碱性磷酸酶染色蓝染较多,成骨分化分子标志物Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2,Runx2）、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,Alp）、Ocn及Dmp1的m RNA表达水平较高。【研究结论】1、在UAC小鼠TMJ髁突软骨下骨中出现可逆性成脂分化增强,成骨分化减弱的形态学表型。2、软骨下骨中Td TLep R+细胞表现出随生物力及生物环境而发生命运选择改变的特征,UAC刺激下更倾向于成脂分化方向;外源性补充Leptin可促进Td TLep R+细胞成骨分化、减弱其成脂分化。（二）Piezo1介导髁突软骨下骨DMP1+成骨细胞转分化为脂肪细胞的实验研究【研究方法】1、在UAC骨丢失模型中利用Td T特异性标记DMP1+成骨细胞,实现对终末分化的成骨细胞的示踪,通过特异性脂肪分子标志物荧光染色判断DMP1+成骨细胞在UAC所致TMJ髁突软骨下骨丢失中的变化。2、通过制作软质（弹性模量:0.12±0.004 MPa）和硬质（弹性模量:28.85±2.58 MPa）的聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane,PDMS）作为细胞培养基底,并在细胞培养过程中分别于培养基中加入Piezo1及其相关分子激动剂或抑制剂,通过细胞荧光染色、细胞化学染色、q RT-PCR和western blot等方法,探究MC3T3-E1成骨细胞在不同硬度基底上的分化活动变化及相应分子机制。3、将DMP1-CreERT2小鼠与Piezo1-flox小鼠杂交获得成骨细胞特异性敲除Piezo1(DMP1Cre ER;Piezo1-/-)小鼠,通过组织化学染色、Micro-CT及荧光染色等实验方法,探究敲除DMP1+成骨细胞Piezo1后TMJ髁突软骨下骨对UAC的响应及相应分子机制。【研究结果】1、与Sham对照组相比,在UAC模型中,DMP1Td T+BODIPY+及DMP1Td T+Adipo Q+细胞占DMP1Td T+细胞的百分比均显著增加。2、与硬质基底培养的MC3T3-E1成骨细胞相比,软质基底培养的MC3T3-E1细胞中Piezo1表达显著降低,细胞骨架较为皱缩,在成骨分化诱导环境下形成的矿化结节较少,成骨分化标志物Ocn及Dmp1表达水平较低,AKT及ERK蛋白磷酸化水平较低;而在成脂分化诱导环境下,油红O阳性染色较多,同时细胞表达脂肪分化标志物Pparg、Fabp4及Adipo Q的水平增高,但AKT及ERK蛋白磷酸化水平较低。3、与DMP1Cre ER;Piezo1fl/fl小鼠相比,DMP1Cre ER;Piezo1-/-小鼠TMJ软骨下骨髓腔面积增大,BV/TV及Tb.Th降低,Tb.Sp升高;OSX及OCN荧光染色阳性细胞数量显著降低,但BODIPY、PPARγ及FABP4荧光染色阳性细胞数量未见明显增加。4、UAC刺激可致DMP1Cre ER;Piezo1fl/fl小鼠出现明显的软骨下骨丢失,BODIPY、PPARγ及FABP4阳性细胞数量明显升高;但是DMP1Cre ER;Piezo1-/-小鼠在UAC刺激后,其TMJ软骨下骨形态学差异不再显著,并且BODIPY、PPARγ及FABP4表达显著减少。5、接受UAC刺激的与未接受UAC刺激的DMP1Cre ER;Piezo1-/-小鼠相比,TMJ软骨下骨的BV/TV、Tb.Th、Tb.N及Tb.Sp不再有明显改变;OSX、OCN、BODIPY、PPARγ及FABP4荧光染色阳性细胞数也不再有明显改变。【研究结论】1、DMP1+成骨细胞处于脱离骨壁的骨髓腔等低硬度基质环境下可向BMAds转分化。2、低硬度基质环境通过减弱Piezo1信号,抑制AKT及ERK的磷酸化水平,抑制成骨细胞成骨活动而促进其成脂分化;敲除Piezo1后,DMP1+成骨细胞对低硬度基质环境不再产生向脂肪细胞转分化的应答。（三）Piezo1介导髁突软骨下骨Adipo Q+成脂细胞转分化为成骨细胞的实验研究【研究方法】1、在骨生成模型（UAC-RE）中利用Td T标记表达Adipo Q的BMAds,实现对成脂细胞的示踪,进而通过特异性成骨分化标志物免疫荧光染色的方法判断TMJ髁突软骨下骨中BMAds在骨生成过程中的分化改变。2、将成脂肪细胞系3T3-L1细胞培养在两种硬度差异较大的基底上,并在细胞培养过程中分别于培养基中加入Piezo1及其相关分子的激动剂或抑制剂,通过细胞荧光染色、细胞化学染色、q RT-PCR和western blot等方法,探究在软质及硬质基底上脂肪细胞中Piezo1表达情况及其介导的脂肪细胞分化改变和相应分子机制。3、将Adipo Q-CreERT2小鼠与Piezo1-flox小鼠杂交获得Adipo Q+成脂肪细胞特异性敲除Piezo1(Adipo QCre ER;Piezo1-/-)小鼠,通过组织化学染色、Micro-CT及荧光染色等实验方法,探究Adipo QCre ER;Piezo1-/-小鼠TMJ髁突软骨下骨对UAC及UAC-RE响应及相应分子机制。【研究结果】1、与UAC组相比,UAC-RE组Td T所标记的BMAds(Adipo QTd T+)明显减少,而Adipo QTd T+OSX+及Adipo QTd T+OCN+细胞占Adipo QTd T+细胞的百分比均显著增加。2、与软质基底培养的脂肪细胞3T3-L1相比,在硬质基底培养的3T3-L1细胞Piezo1表达显著升高,在成骨分化诱导培养环境下形成的矿化结节较多,同时Ocn、Dmp1表达升高,AKT及ERK磷酸化表达水平升高;在成脂分化诱导环境下油红O阳性染色较少,同时细胞Pparg、Fabp4及Adipoq表达较少,AKT及ERK磷酸化水平升高。3、与Adipo QCre ER;Piezo1fl/fl小鼠相比,Adipo QCre ER;Piezo1-/-小鼠TMJ软骨下骨中BV/TV及Tb.Th降低,Tb.Sp升高,PPARγ和FABP4荧光染色阳性细胞数量显著降低。4、UAC-RE可促进Adipo QCre ER;Piezo1fl/fl小鼠软骨下骨质的恢复,同时PPARγ及FABP4表达水平明显降低,OSX及OCN表达水平明显升高;但是Adipo QCre ER;Piezo1-/-小鼠在UAC-RE刺激后,其TMJ软骨下骨形态学差异不再显著。【研究结论】1、Adipo Q+成脂肪细胞在小梁骨增加等高硬度基质环境下可向成骨细胞转分化。2、高硬度基质环境通过增强Piezo1信号,促进AKT及ERK磷酸化,进而促进Adipo Q+脂肪细胞成骨分化;敲除Adipo Q+细胞Piezo1后,Adipo Q+细胞对高硬度基质环境不再产生成骨细胞转分化应答。综上所述,本课题通过采用在体示踪、组织特异性敲除等活体基因修饰技术,以及相关离体实验,利用UAC和UAC-RE动物模型,探究了TMJ软骨下骨改建过程中Lep R+细胞分化改变、成骨细胞-成脂细胞间转分化特征及Piezo1分子机制,获得以下结论:1、TMJ髁突软骨下骨中,Lep R+细胞在UAC刺激下可出现成脂分化增强和成骨分化减弱的表型应答;2、TMJ髁突软骨下骨中,DMP1+成骨细胞和Adipo Q+成脂细胞在UAC及UAC-RE刺激下可发生相互之间的转分化;3、Piezo1介导了与骨髓腔和骨小梁等基质硬度环境相关的DMP1+成骨细胞和Adipo Q+成脂细胞的转分化。