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本文在前人工作的基础上,进一步对转望江南核糖体失活蛋白基因(cassin)的烟草的T<,0>代和T<,1>代进行检测,包括PCR检测、RT-PCR检测和Northern杂交检测。
对T<,0.>代转基因烟草的PCR和RT-PCR检测表明,cassin基因已经插入到烟草的基因组中。Northern杂交的结果与RT-PCR的结果一致,表明cassin已经在转基因烟草植株中进行了转录。
在对T<,0>代转基因烟草的栽培过程中观察转基因烟草和非转基因对照的栽培性状,包括同时期的株高,叶片大小等,发现转基因烟草和非转基因烟草在栽培性状上没有差别,表明cassin基因不会引起烟草栽培性状的改变。
对T<,1>代转基因烟草进行的PCR检测表明cassin基因已经由T<,0>代稳定遗传到T<,1>代。经过统计,发现T<,1>代转基因烟草的PCR阳性和阴性的比例为3:1,证明cassin基因在T<,0>代中是以单拷贝存在的,T<,0>代转基因烟草相当于一个杂合体,csssin基因在T<,1>代进行了分离,其中有2/3的T<,1>代转基因烟草中能检测到cassin基因。
为了筛选出具有抗病性的转基因烟草,对T<,1>代转基因烟草进行了病毒(TMV)接种。接种的结果表明,转基因植株与非转基因的阴性植株相比,对病毒的侵染具有一定的抗性,能推迟发病时间和降低病情的严重度。当接种浓度较低时,转基因植株与非转基因对照的病情指数有明显差异,非转基因烟草对TMV病毒十分敏感,后期症状很严重,已经产生矮化和畸形,而转基因植株的只产生花叶症状,植株生长势基本没有受到影响,在相同的栽培条件下,它们的株高和叶片大小等栽培性状差异很大。随后的ELISA检测表明,转基因烟草体内的病毒含量与非转基因烟草有明显差异。
经过病毒接种后筛选出一株对TMV有早期抗性的转基因烟草植株。接种实验表明转基因株系T<,1>-8-26在接种TMV后70内不表现症状,ELISA检测表明接种后,在该植株中没有检测到病毒粒子。70天后该株系开始表现症状,但只是较轻微的花叶症状,直到开花结果后也没有表现更严重的症状。
对抗病转基因植株T<,1>-8—26进行了RT—PCR检测和Northern杂交,结果表明cassin基因已经稳定遗传到T<,1>-8—26植株中并转录出mRNA,T<,1>-8—26对TMV的抗性有可能是来源于外源基因cassin。
研究表明:cassin基因已经插入到T<,0>代转基因烟草的基因组中中并稳定遗传到T<,1>代,T<,0>代转基因烟草植株对TMV有一定程度的抗性,在T<,1>代抗病转基因烟草T<,1>-8—26中检测到cassin基因已进行转录。本研究对望江南核糖体失活蛋白在植物抗病基因工程中的应用奠定了基础。