谷氨酰胺(Glutamine,Gln),学名2-氨基-4-氨甲酰基丁酸,是植物体内氮运输的主要形式,参与植物体内氨的再同化等代谢作用,在植物的生长发育过程中起重要的作用。谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase,GS)是植物中(GS/GOGAT)氨同化的主要途径,其中GS催化NH4+同化成谷氨酰胺。由于GS是氮代谢的关键酶,并且有研究表明利用GS可以催化谷氨酰胺和乙胺发生转谷氨酰基反应从而得到茶氨酸,因此本研究以此为启发点,研究鉴定了茶树GS基因的功能并进行了 GS工程菌的构建。本文从茶树根部cDNA中成功克隆CsGS1-3(登录号:AB117934.1),并将其与穿梭表达载体pZ8-1连接,通过电转化转入谷氨酸棒状杆菌中对CsGS酶活力进行验证,随后将其与表达载体pET-32a(+)、pGEX-4T-1连接并转入大肠杆菌中进行酶活力验证并进行酶学性质研究。主要研究结果如下:(1)从茶树根部cDNA中成功克隆CsGS1-3,该基因ORF长度为1071bp,由357个氨基酸组成,分子量为39.21 kD,理论等电点为5.47,利用全序列氨基酸序列构建的系统发育树分析表明,茶树的GS序列与猕猴桃的GS序列同源性最高。(2)将CsGS1-3与穿梭表达载体pZ8-1连接后进行测序验证,将测序正确的重组子进行质粒提取,然后电转化转入谷氨酸棒状杆菌中用于构建合成茶氨酸的工程菌,经SDS-PAGE验证蛋白表达情况并进行酶活性检测,酶活结果显示加入底物乙胺盐酸盐有茶氨酸合成。(3)将CsGS1-3与大肠杆菌表达载体pET-32a(+)及pGEX-4T-1连接,并转入大肠杆菌中,经IPTG诱导表达后进行酶活性检测,通过添加不同底物对其合成产物进行检测。测定结果表明pET-32a(+)-CsGS1-3通过添加不同的底物能够合成茶氨酸和谷氨酰胺,而pGEX-CsGS1-3只能合成谷氨酰胺。通过条件优化,对比两个不同重组子的活性,结果表明pGEX-CsGS1-3的活性较pET-32a(+)-CsGS1-3高,但pGEX-CsGS1-3表达量较少,不适用于后续实验。(4)在最佳条件下,谷氨酰胺和茶氨酸合成的含量分别是4.52 mg/mL和0.071 mg/mL。将底物谷氨酸钠:乙胺盐酸盐:盐酸羟胺按照9:4:2的比例添加后,发现同时有谷氨酰胺和茶氨酸产生,且谷氨酰胺(3.9 mg/mL)的合成量是茶氨酸(0.0341 mg/mL)合成量的113.5倍。(5)通过对重组蛋白进行纯化并进行产物分析,发现纯化后的蛋白只能合成谷氨酰胺,并且其活性较粗酶活性降低。