牙周组织缺损最理想的愈合方式是达到牙槽骨、牙骨质和牙周膜的完全功能性再生，而牙周组织再生的基础是牙周膜细胞(PDLCs)，PDLCs是牙周炎治疗后形成牙周新附着的主要细胞来源，但在牙周病损部位，PDLCs的来源非常有限，以致牙周组织很难达到有效地再生和重建，而组织工程技术有望解决这一难题。组织工程学是近年来发展起来的一门新学科，其基本方法是将体外培养的高浓度的功能相关的活细胞种植到具有一定空间结构的三维支架上，再将此细胞支架复合物植入体内或在体外继续培养，通过细胞之间的相互粘附、生长繁殖分泌细胞外基质，从而形成具有一定结构和功能的组织或器官，以达到修复创伤和重建功能的目的。现代广义的组织工程学已包括种子细胞／支架材料、生长因子／支架材料和种子细胞／生长因子／支架材料三种构建方式。为初步探讨组织工程技术在牙周领域的应用潜能，本实验在对重组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)和重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)促牙周组织再生的细胞学机理进行研究的基础上，首次应用前两种构建方式的组织工程技术，对非细胞型和细胞型牙周组织工程进行了研究，以探索在体外及动物模型上应用组织工程学手段促进牙周组织再生的技术和方法，为牙周疾病的治疗提供新的思路和途径，为组织工程在牙周疾病治疗方面的应用奠定实验基础。本研究分为以下三部分： 一、rhBMP-2和rh-bFGF的细胞学基础研究 1．应用MTT比色法和流式细胞仪(FCM)分析技术，检测了rhBMP-2和rh-bFGF单独或联合作用对人PDLCs增殖、DNA合成及细胞周期的影响，以进一步观察分析rhBMP-2和rh-bFGF促人PDLCs增殖的作用及其可能作用机理。结果表明：rhBMP-2和rh-bFGF单独应用均可促进人PDLCs增殖和DNA合成，两者联合应用具有协同作用。rhBMP-2和rh-bFGF的促增殖作用呈剂量依赖性，且rhBMP-2对人PDLCs促增殖作用不如rh-bFGF。而经rhBMP-2和 第四军医大学博士学位论文．4． fhbFGF作用后，人 PDLCS细胞周期的q％（DN合成前期细胞所占百分比） 降低，而S％＊＊A合成期细胞所占百分比）升高，反映细胞增殖活力的增殖指 数h值（包括DNA合成期侣），DNA合成后期闷力和有丝分裂期则）的细胞所 占百分比，即侣十GZM）％）也明显升高，提示 hBMP2和山七FGF促人 PDLCS 增殖的作用可能是通过促使静止态的Q期细胞活跃进入S期而实现的。 2．采用考马斯亮蓝法检测rhBMPZ和山七FGF作用后人PDLCs总蛋白含 量的变化，并通过透射电镜观察这两种因子作用下人PDLCS超微结构的改变， 以进一步探讨rhBMP－2和山七FGF对人PDLCs蛋白合成和分泌功能的影响。 结果表明：hBMP－2单独应用时可显著提高人PDLCs的总蛋白含量，在25～ 100pg／L浓度范围内呈浓度依赖性，而rhbFGF表现为降低人PDLCs的总蛋白 含量，但至第7天这种作用趋于缓和。两者联合应用时自第5天起仍表现为提 高人 PDLCs的总蛋白含量。透射电镜观察可见 rhBMP－2作用后人 PDLCs DNA 合成和蛋白合成、分泌功能加强，而rhbFGF作用后PDLCs DNA合成活跃， 而蛋白合成相关细胞器未见明显变化，提示rhBMPZ可促进PDLCs的DNA合 成、蛋白合成和分泌，而rhbFGF促进PDLCs的DNA合成，但可能抑制其外 输性蛋白质的合成和分泌。 3．应用Western斑点杂交方法检测rhBMP－2和山七FGF作用后人PDLCs 中 OCN、OPN和 BSP mRNA的表达情况，以进一步探讨rhBMP．2和山七FGF 对人PDLCs分化功能的影响。结果表明：rhBMP－2可促进人PDLCS中OCN、 OPN、BSP mRNA的表达，而 rh七FGF不影响人 PDLCs中 OCN、OPN、BSP ITu：＼xA的表达，两者联合应用时山－bFGF对rhBMPZ的促OCN、OPN、BSP Ilin－guA表达的作用也无影响。提示AnMPZ可能通过促进人PDLCS矿化相关 蛋白的表达而促进人PDLCS的分化。 二、rhBMP毛和山1FGF应用于牙周组织工程的实验研究 l．将rtl．－－MP上和rh七FGF与nHAC复合后植入动物体内修复牙周缺损， 通过组织学观察和测量分析和评价非细胞型组织工程技术对牙周组织再生的作 第四军医大学博士学位论文．5． 用。结 果 表 明：rtl．－－MPZ／nHAC／膜 组、rhbFGF／nHAC／膜组 和 nMP士／山七FGF／nHAC／膜组均较空白对照组和单纯GTR组有更多的新生牙槽 骨、新生牙周膜和新生牙骨质生成，且均未见上皮长入，提示应用生长因子／ 支架材料构建方式的组织工程方法可有效地促进牙周组织再生和重建。 2．应用免疫组化方法对上述各实验组再生的牙周组织中BSP、OPN及 ON的表达进行了比较，以观察分析不同实验组促牙周组织再生作用h不同。 结果表明：各实验组新生牙周组织中BSP、OPN、ON的表达量均较空白对照 组和单?