双组分信号转导系统(Two-component signal transduction system, TCS)是细菌体内最重要的信号转导系统,调控着细菌的大部分生命活动。其机制高度保守,是理想的新型抗菌药物靶标。在细菌的双组分信号转导系统中,通常由组氨酸激酶(Histidine kinase, HK)和应答调节蛋白(response regulator, RR)两个蛋白组成,它们之间通过磷酸基团的传递实现信号的转导,磷酸化后的应答调节蛋白可以调控一些特殊基因的表达。相对于真核细胞的信号转导机制,TCS具有不同的转导方式,主要表现在组氨酸激酶(HK)具有双功能,既能磷酸化下游的应答调节蛋白(RR),也能作为磷酸酶催化磷酸化态RR的去磷酸化。HK的去磷酸化功能在细菌体内极为重要,是控制信号基线水平、调节细菌生命活动有序进行的重要保障。在该体系的研究中,RR蛋白的活化过程以及HK行使磷酸酶功能的具体机制尚不清楚,存在较大的争议。由于HK具有双功能容易造成无效的磷酸传递,因此了解HK如何降低无效传递是理解细菌信号转导机制的最基础的问题之一。针对以上的问题,本文采用核磁共振技术和X射线晶体衍射技术,对细菌双组分信号转导系统HisKA亚家族中源于Thermotoga maritima功能未知的HK853和RR468蛋白质及其复合体进行结构和机制的研究。磷酸化态的RR468半衰期较短,不利于研究信号转导系统的磷酸转移机制。我们运用小分子探针三氟化铍BeF3-模拟磷酸基团,并将其应用到双组分信号转导机制的研究中来。首先,我们系统地研究了氟化铍体系在溶液中的复杂交换网络和性质,通过19F NMR发现其分布规律和动力学性质,并且发现二价镁离子能够提高不同种类氟化铍之间的交换速率,提出了离子对模型机制用于解释二价镁离子对氟化铍系统的影响机制。通过运用磷酸基团类似物BeF3-和同位素标记,我们可以研究溶液中RR.468非磷酸化的自由态(apo)和类磷酸化态(holo)的性质。研究结果发现RR468在溶液中的二级结构呈现典型的p5-a5组合构象。我们运用15N弛豫机制研究apo RR468皮秒到纳秒(ps-ns)时间尺度的动态特征,并且运用CPMG Relaxation Dispersion实验研究apo和holo RR468在溶液中微秒到毫秒(μs-ms)时间尺度的动态变构。结果发现溶液中自由态的RR468动态过程是分级的,较快时间尺度的运动有利于瞬态氢键的形成从而降低构象转变的能垒,而较慢时间尺度的动态则很可能和磷酸转移催化过程相互关联,以及用于稳定蛋白质的构象。通过运用该氟化铍体系,我们实现了稳定类磷酸化态RR468的制备,运用19F NMR等核磁共振方法,我们成功地观测了磷酸基团类似物BeF3-在RR468活性中心以弱化学键方式与蛋白质氨基酸侧链形成的相互作用网络。以BeF3--RR468为底物,我们运用19F NMR以及动力学研究,揭示了HK853行使磷酸酶功能的具体分子机制,发现在HisKA家族中,主要是DHp结构域参与相互作用,我们鉴定出Dnp结构域中的HxxxT模体是起催化作用最主要的残基,并提出了HK催化P-RR去磷酸化详细机制的假说。通过共结晶方法,我们成功获得了HK853-BeF3--RR468蛋白质复合体单晶,运用X射线晶体衍射,解析了2.9A高分辨的蛋白质复合体结构。我们获得了磷酸化产物RR处于受保护的构象,结合NMR数据,揭示了TCS系统防止无效磷酸传递的机制：HK853的DHp结构域与底物相互作用时具有两种构象的分布,且受pH调控；CA结构域与底物具有疏水相互作用从而保护活性位点,用于阻隔水分子的进入和防止磷酸基团的脱落。基于本文所发现的机制,我们运用基因定点突变的方法设计了具有不同催化能力的HK蛋白。综上所述,我们系统地研究了磷酸基团类似物氟化铍交换网络和分布规律以及二价镁离子对其动力学性质的影响,并将其应用到蛋白质的磷酸传递研究中。本文提出细菌双组分信号转导系统应答调节蛋白RR构象转变的动态过程是分级的且和功能相关。本文尝试从结构、动态和功能之间的联系出发揭示生物大分子的机制,解析了蛋白质复合体的高分辨晶体结构,发现了HK行使磷酸酶功能的关键模体单元,阐述了TCS系统HK蛋白在行使磷酸酶功能和信号保护功能之间切换的分子机制。我们的研究结果对细菌双组分信号转导机制的研究具有重要的参考价值,有助于打开新型抗菌药物的设计思路,同时本文建立的研究方法可以为类似蛋白质体系的研究提供可借鉴的经验,有助于揭示更多重要的生命活动机理。