目的:中医药作为传统经验和智慧的结晶,在我国医疗体系中具有重要地位。中药资源是中医药发挥功效的物质基础,其质量直接影响着临床的疗效,更是关系着中医药的生死存亡。导师郭姣教授带领团队致力于中西医结合防治代谢性疾病三十余年的研究中,“中西结合、医药结合、基础临床结合”,通过不断积累的临床与实验研究,倡导“中西医防治代谢性疾病方药研究应贯穿中药的基源控制、生药鉴定、提取加工、制剂生产及质量检验等全过程”的“医、产、学、研”有机结合思维。中药材是中药制剂的源头,中药材的质量,直接决定中药产品的质量,进而直接影响临床的疗效。目前,我国心血管病患病人数为2.9亿,据统计,中国总死亡人群中,每5个人中有2人是心血管病患者,心血管病成为人类健康第一大杀手。而丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge),是世界公认的治疗心脑血管疾病的主要药物之一,代表性中成药复方丹参滴丸是我国第一例顺利完成美国FDAⅡ期临床试验的复方中药,但随着市场需求增加,丹参栽培面积也越来越大。随着丹参连作和种植年限的延长,根部病害严重发生,土传病害成为影响丹参药材质量和品质的主要原因,病害的发生率达到了 60%-70%,严重制约了丹参在心脑血管疾病上的应用。丛枝菌根(Arbuscular Mycorrhizal,AM)真菌是自然界中分布最广泛的一类与植物共生的真菌,能增强宿主植物防御土传病害的能力,茉莉酸作为植物重要的激素之一,不仅在AM菌调控植物生长发育及抗病性方面起到重要的作用,还与AM真菌共生定植有关。细胞跨膜离子流是作为植物响应外界胁迫防御信号网络中的初始信号,是揭示植物防御机理的关键。目前茉莉酸调控植物防御反应的分子机制比较清楚,但AM真菌与植物茉莉酸之间存在怎么的关联,是否通过调节JA从而增强植物防御能力,而防御早期信号细胞跨膜离子流在AM真菌与JA之间又起到怎么的作用,目前相关的研究较少。本论文采用整体植株丹参及离体植株胡萝卜共培养毛状根为材料,研究AM、JA以及离子信号三种之间的关系,旨在阐明AM真菌对JA的作用及其作用机制,同时阐明其对跨膜离子流的影响,从而揭示AM、JA以及跨膜离子流信号之间的关系。该研究为AM真菌在栽培药材抗病性中的应用提供指导,促进AM真菌在中药材栽培中的应用。方法:1、本实验植物激素采用异丙醇:水:HCI(2:1:0.002)提取液提取,二氯甲烷萃取,进而应用超高效液相色谱-质谱联用,以多反应监测(MRM)进行定量分析;2、本实验植物丹参未接种和接种GI菌剂生长45d后,进行短期处理和长期处理实验。短期处理GI组给予JA抑制剂SHAM高(500 μmol/L)、中(100 μ mol/L)、低(10 μ mol/L)三个浓度进行喷施,同时以喷施蒸馏水CK组与GI组为对照,分别于喷施后0.5h、2h、6h、12h、24h、48h收获测定指标;长期处理CK组和GI组分别喷施100 μmol/L MeJA、100 μmol/LSHAM,同时以喷施蒸馏水为对照,每2天喷施一次,连续处理2周共喷施7次,停止处理1周后,收获测定指标;用UPLC/MS/MS测定内源激素的含量,用实时荧光定量PCR测定JA合成相关基因AOS、AOC、OPR、AR1的表达量和信号通路相关基因JAZ、COI和JMT的表达量,用UPLC检测丹参有效成分丹酚酸类含量,用HPLC检测丹参有效成分丹参酮类含量;3、本实验以丹参未接种GI菌剂和接种GI菌剂为材料,生长45d后,分别给予100 μ mol/LMeJA、100 μmol/L SHAM喷施处理,连续喷施两周后采用非损伤微测技术测定丹参植物Ca2+、K＋、H＋矿离子流;4、本实验通过对M培养基和6-7-V培养基成分进行比较,筛选影响丹参毛状根和共培养菌剂生长的培养基的成分Na元素、P元素、K元素、C1元素和蔗糖,设计正交试验,进行丹参毛状根共培养体系建立的研究;5、本实验以胡萝卜毛状根及胡萝卜共培养毛状根为实验材料,给予0.1 mmol/L MeJA、0.1 mmol/L SHAM 进行处理 0.5h、lh、2h、4h、8h、12h 后,用 UPLC/MS/MS测定内源激素JA、OPDA、JA-ile的含量及其他内源激素的含量,同时采用实时荧光定量PCR检测JA合成相关基因AOC、OPR、JAR1的表达量和信号通路相关基因COI和JAZ的表达量;6、本实验以胡萝卜毛状根及胡萝卜共培养毛状根为实验材料,给予0.1 mmol/L MeJA、0.1 mmol/L SHAM进行处理2h后,采用非损伤微测技术测定Ca2+、K+、H+矿离子流。结果:1、AM真菌对丹参植物内源激素含量的研究结果:内源激素JA、OPDA、JA-ile、ABA、SA、GA3、IBA采用负离子扫描模式,MeJA采用正离子扫描模式,在建立的UPLC/MS/MS条件下均得到有效的分离,各内源激素在线性范围内的相关系数(r)在0.9914~0.9991的范围内;丹参植物根和叶片中JA和ABA高、中、低三个浓度加样回收率在80.40%~97.00%之间;日内和日间精密度RSD均低于10.0%;稳定性和重复性RSD均低于8.0%。丹参植物接种GI菌剂45d后根部和叶片JA、OPDA、JA-ile、MeJA的含量均显著高于未接种GI菌剂对照组,ABA的含量均显著低于未接GI菌剂对照组,而GA3、SA、IBA在丹参植物根和叶片中均未检测到。2、MeJA及SHAM处理条件下AM真菌对内源激素作用的研究结果:(1)无论是短期处理,还是长期处理,喷施蒸馏水处理GI组丹参地上部分和地下部分JA、OPDA和JA-ile均显著高于CK组,且JA合成途径相关基因AOS、AOC、OPR、JAR1的表达量均上调;丹参其他内源激素ABA、SA和GA3含量均降低。(2)短期处理GI组给予不同浓度SHAM溶剂处理后,丹参地上部分JA、OPDA、JA-ile的含量均显著降低,且JA合成途径相关基因AOC、OPR、JAR的表达量均下调,JA信号通路COI、JAZ和MT基因的表达量并未出现变化;而GI组给予SHAM抑制剂处理后,丹参地下部分JA、OPDA和JA-ile的含量48h内显著增加,JA合成途径相关基因AOS、AOC、OPR、JAR的表达量上调,JA信号通路COI、JAZ和JMT基因的表达量出现显著变化,这与地上部分结果相反。(3)CK组和GI组长期给予MeJA处理两周后,无论是丹参地上部分还是地下部分,均能显著增加丹参内源激素JA及其中间合成产物OPDA、JA-ile的含量,上调JA合成相关基因AOC、OPR、JAR的表达量;CK组和GI组长期给予SHAM抑制剂处理两周后,无论是丹参地上部分还是地下部分,均能显著降低丹参内源激素JA及其中间合成产物OPDA、JA-ile的含量,下调JA合成相关基因AOC、OPR、JAR的表达量。(4)长期给予蒸馏水处理两周后,GI组丹参地上部分和地下部分水溶性成分咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和脂溶性成分隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的含量均显著高于CK组;长期给予MeJA处理两周后,均能显著提高GI组和CK组丹参地上部分和地下部分有效成分含量;长期给予SHAM处理后,均能显著降低GI组和CK组丹参地上部分和地下部分有效成分含量。3、丛枝菌根真菌GI参与调节丹参茉莉酸跨膜离子流作用机制研究结果:(1)喷施蒸馏水处理,CK组的H+离子处于内流的状态,Ca2+离子和K+离子处于外排的状态;当给予SHAM处理两周后,CK组H＋离子瞬时内流,Ca2+离子瞬时外排,K+离子瞬时内流;当给予MeJA处理两周后,CK组H＋离子瞬时外排,Ca2+离子瞬时内流,K+离子瞬时外排。(2)丹参接种AM真菌45d喷施蒸馏水处理后,H+离子显著内流,Ca2+离子显著内流,K+离子显著外排;当给予SHAM处理两周后,GI组H+离子显著外排,Ca2+离子显著外排,K+离子显著内流;当给予MeJA处理两周后,GI组H+离子显著外排,Ca2+离子显著外排,K+离子显著内流,给予MeJA处理结果与CK组给予MeJA处理结果相反。4、丹参毛状根共培养体系建立研究结果:影响丹参毛状根生长条件因素大小顺序排列为:KC1含量(A)>NaH2PO4+Na2HPO4含量(功>蔗糖(C),而培养两个月的丹参毛状根在解剖显微镜下观察正交设计的九组实验共培养体中孢子均破裂,且通过侵染率的鉴定九组实验丹参毛状根共培养根系侵染率均为0,未能建立丹参毛状根共培养体系。5、MeJA及SHAM处理胡萝卜共培养毛状根内源激素作用机制的研究结果:(1)胡萝卜毛状根接种GI菌剂共培养一个月后,内源激素JA含量均有提高的趋势,1h和8h有显著差异;而GI组OPDA和JA-ile的含量2h前均低于CK组,2h后高于CK组,这与AM真菌对丹参植物JA作用机制不同。(2)MeJA处理后,GI组和CK组JA和JA-ile的含量均增加,而OPDA并未出现相同的规律;SHAM处理后,GI组和CK组JA和JA-ile的含量均降低,而OPDA同样未出现相同的规律,这与AM真菌对丹参植物JA作用机制不同。6、胡萝卜共培养毛状根茉莉酸跨膜离子流作用机制研究结果:(1)胡萝卜毛状根培养一个月后,CK组的H+离子处于外排,Ca2+离子处于内流和K+离子处于外排的状态;当给予SHAM处理两周后,CK组H+离子瞬时外排,Ca2+离子瞬时外排,K+离子瞬时内流;当给予MeJA处理两周后,CK组H+离子瞬时内流,Ca2+离子瞬时内流,K+离子瞬时内流。(2)胡萝卜毛状根接种GI菌剂共培养1个月后,GI组H+离子显著内流,Ca2+离子显著内流,K+离子显著外排;当给予SHAM处理两周后,GI组H+离子瞬时外排,Ca2+离子瞬时外排,K+离子瞬时内流;当给予MeJA处理两周后,GI组H+离子显著外排,Ca2+离子显著外排,K+离子显著内流。结论:1、本研究建立了一套新鲜植物丹参内源激素UPLC-MS/MS分析方法,该方法灵敏度高、特异性高、准确度高,重复性好,适用于AM菌根侵染丹参内源激素的含量测定。2、(1)AM菌剂能显著增加丹参地上部分和地下部分JA、OPDA、JA-ile的含量,上调JA合成相关基因AOC、OPR、AR的表达量,AM真菌能降低丹参其他内源激素ABA、SA和GA3的含量。(2)短期SHAM处理AM真菌对丹参地下部分JA、OPDA和JA-ile含量的变化与地上部分和长期处理实验结果相反,分析其原因可能是AM真菌对JA介导防御作用与外源施加SHAM的时间有关,AM真菌与丹参植物根部进行侵染,进而促进丹参增强响应瞬时外部环境变化的防御能力,当短期给予SHAM处理后,AM真菌瞬时识别外来胁迫刺激,进而促进JA合成合成途径,上调JA合成相关基因,增加OPDA和JA的含量,进一步合成大量的JA-ile,启动JA信号通路,调节COI和JAZ基因的表达量,启动防御基因的表达,从而起到防御外界胁迫刺激的作用;而长期SHAN处理,JA适应外界环境胁迫,识别外来的SHAM溶剂刺激并非伤害,故地上部分和地下部分OPDA、JA和JA-ile均显著下降。(3)AM真菌显著降低丹参地上部分和地下部分其他内源激素ABA、SA和GA3的含量,喷施MeJA后,CK组和GI组其他内源激素ABA、SA和GA3的含量均降低,而喷施SHAM后,CK组和GI组其他内源激素ABA、SA和GA3的含量均增加,表明植物丹参内源激素JA与其他内源激素ABA、SA和GA3存在相互拮抗的作用,通过调节丹参植物机体的激素平衡促进丹参植物的生长和适应外界环境的变化。(4)AM真菌能显著增加丹参水溶性成分咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B,以及脂溶性成分隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的含量。AM真菌可能一方面促进丹参次生代谢产物的增加进而起到防御外界环境的作用,另一方面促进丹参植物内源激素JA含量的增加,协同JA诱导丹参次生代谢产物的增加,进而增强防御外界胁迫的能力。3、(1)跨膜离子信号参与到茉莉酸介导的防御反应中。当MeJA跨膜进入细胞质后,在MT的作用下合成JA,使植物体内JA含量增加,进而在JAR1作用下合成JA-ile,JA-ile与SCFCOI1结合,在COI的作用下,JA激活质膜H+-ATP酶,导致H+跨膜外排,H+外排建立的电化学势差去级化激活Ca2+通道,Ca2+内流,进而激活阴离子通道,去极化质膜导致K+外排。跨膜Ca2+和H+离子流在JA启动防御响应的初始阶段发挥作用,跨膜Ca2+离子内流导致的胞质内Ca2+浓度变化起到传递并放大信号的作用,从而将信息传递给细胞质内的靶分子,增强植物对病原菌等外界胁迫刺激的防御响应。(2)丹参与AM真菌识别形成共生体的早期信号伴随着离子动态组的转导,AM真菌在与寄主植物共生的过程中,离子信号H+、Ca2+、K+等作为共生诱导的早期信号起到重要的作用,丹参接种AM真菌后H+离子显著内流,Ca2+离子显著内流,K+离子显著外排。但GI组给予MeJA喷施处理两周后,离子信号的变化与CK组的相反,推测可能是AM真菌对JA信号转导通路的调节存在负反馈的作用,当植物体内MeJA含量显著增加后,AM真菌会负反馈调节JA诱导的离子动态组,超极化激活钙通道,启动负反馈调节作用,使Ca2+外排,以防止过多的Ca2+流入细胞质,而K+内流可能用来弥补钙离子激增导致的电荷不平衡。4、丹参需要营养成分较高的培养液,而AM真菌需要营养较低的培养液,培养基营养较高可能会导致AM真菌孢子渗透压过高破裂而无法生长。课题组后期需对AM真菌与丹参毛状根的双重培养体系的培养基进行摸索研究,力争寻找满足AM真菌与丹参毛状根双方需求的培养基。本课题后续将采用胡萝卜毛状根共培养体系进一步揭示AM真菌对茉莉酸的作用机制的研究,更好地阐明动态离子信号在AM真菌对JA介导的信号通路中的作用。5、(1)OPDA的合成位于植物的叶素体中,而共培养体系中用离体培养的根取代了整个植株,这可能会导致AM真菌有益于植株的作用会受到植物光合作用的缺失而受到影响,这可能是胡萝卜离体共培养与AM侵染丹参植物喷施MeJA和SHAM对于内源激素OPDA含量影响存在区别的原因之一;此外,共培养的M培养基中的大量碳水化合物通过根表皮直接进入皮层和菌根丛枝系统,可能会改变菌根-植物相互作用的化学平衡,这可能是导致胡萝卜共培养体系与丹参植物短期处理盆栽作用结果不一致的原因之二。(2)AM真菌对胡萝卜毛状根JA作用机制与丹参结果不同,表明胡萝卜毛状根用离体培养的根代替整个植株,但并不能代替整体植株的生理功能作用,建议今后研究AM真菌对JA的作用机制应慎用毛状根。6、AM真菌调节JA信号转导途径增强防御能力时,对离子通道有正、负调节的作用。当植物体内MeJA含量显著增加后,AM真菌会负反馈调节JA诱导的离子动态组,超极化激活钙通道,启动负反馈调节作用,使C2+外排,以防止过多的Ca2+流入细胞质,而K+内流可能用来弥补钙离子激增导致的电荷不平衡。