兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease, RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)引起的危害3月龄以上青年兔和成年兔的一种急性、烈性、高度接触性传染病。该病于1984年在中国首次报道后,在世界各地相继发生。迄今,RHD已成为兔的一种毁灭性传染病,给养兔业带来了巨大的经济损失。从1984年RHD首次报道至今,关于RHDV的研究已经取得了很大的发展,但国内外的研究学者至今仍未发现一株能进行RHDV稳定繁殖的细胞系,故而就缺少一个可以从分子水平研究病毒的技术平台,这严重阻滞了对RHDV的研究,因此,RHDV致病的分子机理至今仍不十分清楚。在RHD的发生发展过程中,肝脏是病毒增殖的主要器官。临床病理解剖中肝脏的病理变化最为严重,并且在RHDV大量制备纯化的方案中,病死兔的肝脏往往是病毒的重要来源,研究者直接取肝脏匀浆后提取病毒,所以从肝脏细胞出发,寻找与RHDV相互作用的细胞表面蛋白具有重要意义,现已有研究证实RHDV可感染原代兔肝脏细胞。VP60是RHDV的主要衣壳蛋白,研究表明VP60蛋白与RHDV的致病性和免疫原性有着密切关系,故研究能与VP60蛋白相互作用的兔肝细胞表面蛋白,对了解RHDV致病的分子机制以及RHD的防控具有重要意义。本研究拟采用SMART技术,将兔肝脏cDNA定向克隆到pEXP-Lib载体中,构建兔肝脏细胞的真核表达文库。采用表达克隆法筛选文库,以纯化的VP60为诱饵蛋白,从真核表达文库中筛选能与VP60蛋白发生相互作用的蛋白。通过免疫共沉淀试验、血凝抑制试验,体外验证蛋白之间的相互作用;借助激光共聚焦试验技术证明蛋白在细胞内的共定位。实验结果表明,兔肝脏细胞真核表达文库的鉴定结果显示插入片段分布在0.3 kb ~ 2.0kb之间,重组率约为86%,表明获得了高质量的兔肝脏细胞真核表达文库。筛选结果显示有26个EST片段与兔功能基因有较高的同源性,序列分析以及对蛋白的功能性分析,膜突蛋白(Moesin)可与VP60发生相互作用,故对Moesin进行进一步的相互作用验证以及功能性研究。以兔肝脏cDNA为模板,扩增Moesin部分片段基因688nt~2157nt,分别连接到载体pET-30a和pEGFP-N1上,构建Moesin的原核表达载体pET-30a-Msn和真核表达载体pEGFP-N1-Msn。将pET-30a-Msn重组表达载体转化E.coli感受态细胞,诱导表达并纯化获得可溶性Moesin蛋白,通过免疫共沉淀试验和血凝抑制试验验证Moesin与VP60的相互作用。同时,将pEGFP-N1-Msn与pcDNA3.1-VP60重组表达载体共转染HEK293T细胞,采用激光共聚焦试验技术对Moesin与VP60在细胞内的共定位进行分析,证明了Moesin与VP60在哺乳动物细胞内能够通过相互作用达到共定位。本研究通过表达克隆法从兔肝细胞真核表达文库中筛选到Moesin基因,并在体外成功表达了Moesin部分片段基因,证明了其与RHDV VP60蛋白之间存在相互作用,为RHDV致病机理的研究奠定了基础。