论文部分内容阅读
本研究基于蔷薇科基因组数据库,根据梨及其它三个蔷薇科物种的蛋白质序列和保守结构域进行分类和系统发育分析,从而鉴定出蔷薇科CAD基因家族,利用生物信息学分析阐明其进化历程。对‘砀山酥梨’及其愈伤组织进行不同浓度钙处理,以木质素含量、石细胞含量及CAD酶活性变化为指标筛选抑制石细胞形成的适宜钙浓度。通过qRT-PCR分析PbrCAD基因在钙诱导下的表达情况。克隆基于生物信息学分析及相关试验数据筛选影响石细胞形成的关键基因PbrCAD1,并进行亚细胞定位。研究取得的主要结果如下:1.本研究以梨(Pyrus bretschneideri)、苹果(Malus domestica)、梅子(Prunus mume)和草莓(Fragariavesca)为研究材料,将其分别命名为PbrCAD,MDPCAD,PmCAD和mrnaCAD,并对蔷薇科物种的CAD基因进行生物信息学分析。试验结果表明:4个蔷薇科物种共包含中149个均具有ADH-N和ADH-zinc-N保守结构域的CAD基因家族成员,通过系统进化树分析将它们分为6个亚家族;蔷薇科物种CAD基因家族基因在染色体上呈不均匀状态分布,通过同一物种之间共线性分析可知这4个蔷薇科物种间共有9对共线性基因;分散复制和全基因组复制在进化事件中所占的比例最大,是CAD基因扩增的主要方式。2.利用生物信息学的方法在梨基因组中鉴定得到了 57个CAD家族基因,并对它们的系统进化树、基因结构、保守序列、Ka/Ks等进行了分析讨论。通过转录组数据和石细胞分布、石细胞含量变化筛选可能参与木质素合成的PbrCAD基因,通过qRT-PCR检测候选基因的表达量以进一步确定参与木质素合成的关键基因。试验结果表明:梨CAD基因家族成员共分为7个亚家族,同一家族成员包含相似的基因结构与保守序列;梨中5对共线性基因Ka/Ks均小于1,说明了这些基因在进化过程中都经历了纯化选择;转录子数据揭示了 51个梨CAD基因在果实发育过程中表达,通过荧光定量数据筛选出4个可能参与木质素形成的PbrCAD基因。3.以‘砀山酥梨’为试验材料,通过喷施不同浓度钙(CK,0.25%,0.5%,0.75%),分析果实发育过程中单果重、石细胞含量、木质素含量、肉桂醇脱氢酶活性的变化,测定钙处理下PbrCAD基因的表达量。试验结果表明:随着果实生长发育,喷施0.5%浓度钙的单果重始终低于其它处理中的果实重量;梨果实中的石细胞含量与木质素含量均呈现先升高后降低的趋势,石细胞中木质素含量呈现先上升后趋于平缓的趋势,0.5%浓度钙处理中它们的含量最低。CAD酶活性在果实整个生长过程中呈下降趋势,喷施0.5%浓度钙能够明显抑制其活性。PbrCAD1在钙处理中基因表达量显著降低。在实际生产应用中,0.5%钙肥对降低石细胞含量,提高果实品质具有重要作用。PbrCAD1可能在梨果实木质素合成中起主要作用。4.通过对‘砀山酥梨’幼果的诱导,使其产生外植体,然后经过多次继代培养筛选出黄白色、质地疏松、生长旺盛、生长速度一致的愈伤组织作为试验材料。试验结果表明:适合诱导‘砀山酥梨’幼果生成愈伤组织的培养基为:MS+2.0mg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+75mg/LVc,诱导率为95%;适合愈伤组织继代培养的培养基为:MS+2.0mg/L 2,4-D+1mg/L 6-BA+1mg/L KT,愈伤组织增殖率达81.5%;5.以‘砀山酥梨’愈伤组织为试验材料,分析不用浓度钙(CK,0.25%,0.5%,0.75%)对愈伤组织生长发育过程中木质素含量、CAD酶活性等的影响。试验结果表明:低浓度钙离子能够降低肉桂醇脱氢酶的活性,抑制木质素单体的氧化聚合,从而降低木质素含量;高浓度钙对愈伤组织的生长起到抑制作用,导致愈伤组织继代周期缩短,易褐化。6.为了深入研究梨关键PbrCAD基因的功能,对带酶切位点的PbrCAD1的开放阅读框架(ORF)进行PCR扩增,构建了PbrCAD1与绿色荧光蛋白(GFP)融合的植物表达载体p35S-PbrCAD1-GFP。通过荧光显微镜观察植物表达载体在烟草叶片表皮细胞中分布以确定基因在细胞中的定位表达。研究结果表明:PbrCAD1基因的重组表达载体定位在细胞膜上。