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研究背景:动脉粥样硬化（atherosclerosis, As）是缺血性心脑血管病的病理基础,目前认为属慢性炎症性或自身免疫性疾病,但发病机制尚未完全清楚。Toll样受体（toll-like receptors, TLRs）是一类重要的模式识别受体,作为新的炎症信号传递门户蛋白,是免疫反应、慢性炎症和脂代谢紊乱间的桥梁。血管紧张素II（angiotensin II, Ang II）在As等疾病的发病机制中扮演重要角色。Ang II与其受体结合后激活多种信号通路,诱导血管细胞释放多种细胞因子及生长因子,诱发血管炎性反应,导致As发生发展,但Ang II致炎效应与TLR4之间的关系及相关信号通路,国内外尚未见报道。过氧化物酶增殖体激活受体（peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs）是一类由配体激活的核转录因子,与代谢、炎症及As发生等有关。PPARα激动剂非诺贝特和PPARγ激动剂罗格列酮具有抗炎和抗As作用,但作用机制并不完全清楚,是否与干扰TLR4的信号转导有关尚不十分清楚。研究目的:1.观察Ang II对血管平滑肌细胞（VSMCs）中TLR4表达及炎性因子产生的影响,探讨Ang II的致炎效应与TLR4信号通路的关系,为阐明As的发病机制提供新的理论依据;2.研究非诺贝特和罗格列酮对Ang II刺激的VSMCs中TLR4表达及炎性因子产生的影响和分子机制,以期阐明PPARs激动剂新的抗炎和抗As作用机制。研究方法:1.动物实验利用微渗透泵大鼠皮下埋植方法,在体输注Ang II（150 ng/kg/min）,同时灌胃给非诺贝特（150 mg/kg）和罗格列酮（5、10 mg/kg）。用放射免疫法测定血清TNF-α和血浆6-酮-前列腺素F1α（6-keto-PGF1α）;免疫荧光双标染色法检测主动脉平滑肌TLR4和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达;western blot、real-time PCR法检测主动脉平滑肌TLR4、MMP-9、PPARα及PPARγ表达。2.细胞培养和处理原代培养大鼠VSMCs,以不同浓度Ang II(10-9～10-6 M)和LPS（50～200 ng/ml）刺激细胞;另一组预先1 h加入非诺贝特（25～100μM）或罗格列酮（2.5～10μM）,再用10-7 M Ang II刺激12、24、36、48 h后,用ELISA法测定细胞上清液中TNF-α和6-keto-PGF1α,细胞免疫荧光染色法检测VSMCs中TLR4和MMP-9表达,同法检测VSMCs中TLR4、MMP-9、PPARα及PPARγ表达。3. Ang II刺激VSMCs产生炎性因子的TLR4信号通路研究预先1 h加入TLR4阻断剂,再用10-7 M Ang II刺激细胞24 h,同法测定细胞上清液TNF-α和6-keto-PGF1α、VSMCs中MMP-9、PPARα及PPARγ的表达。预先30 min加入AT1抑制剂losartan、AT2抑制剂PD123319、ERK1/2抑制剂PD098059或不同的联合,再用10-7 M Ang II刺激细胞24 h,同法检测VSMCs中TLR4表达。预先30 min加入TLR4阻断剂,再用10-7 M Ang II刺激细胞24 h,同法检测VSMCs中IP-10表达。预先1 h加入IP-10阻断剂,再用10-7 M Ang II刺激细胞24 h,同法检测VSMCs中PKC表达。预先1 h加入PKC抑制剂白菜屈红碱（CH）,再用10-7 M Ang II刺激细胞24 h,同法检测细胞中NF-κBp65表达。4.小分子干扰RNA（small-interfering RNA, siRNA）培养VSMCs,按照试剂盒说明用DharmaFECT 2转染试剂将TLR4 siRNA, IP-10 siRNA或negative control siRNA（NC siRNA）瞬时转入VSMCs中。在转染NC siRNA或TLR4 siRNA 48 h后,预先1 h加入非诺贝特（100μM）或罗格列酮（10μM）,用10-7 M Ang II刺激细胞24 h,同法测定细胞上清液TNF-α和6-keto-PGF1α、VSMCs中MMP-9、PPARα和PPARγmRNA表达。5.非诺贝特和罗格列酮对Ang II刺激VSMCs产生炎性因子TLR4信号通路的影响研究预先1 h加入TLR4阻断剂,再给予非诺贝特（100μM）或罗格列酮（10μM）作用1 h,然后用10-7 M Ang II或100 ng/ml LPS刺激细胞24 h,同法测定细胞上清液TNF-α和6-keto-PGF1α、VSMCs中MMP-9、PPARα和PPARγ蛋白表达。预先30 min加入losartan、PD123319、PD098059,再给予非诺贝特（100μM）或罗格列酮（10μM）作用1 h,然后用10-7 M Ang II刺激24 h;预先1 h加入非诺贝特（100μM）或罗格列酮（100μM）,再用10-7 M Ang II刺激5 min或24 h,同法检测VSMCs中TLR4、ERK1/2和AT1蛋白表达。细胞在转染NC siRNA或TLR4 siRNA 48 h后,预先1 h加入非诺贝特（100μM）或罗格列酮（100μM）,再用10-7 M Ang II刺激24 h,同法检测VSMCs中IP-10蛋白表达;另一组细胞在转染NC siRNA或IP-10 siRNA 48 h后,预先1 h加入非诺贝特（100μM）或罗格列酮（10μM）,再用10-7 M Ang II刺激24 h后,同法检测VSMCs中PKC蛋白表达。预先1 h加入CH,再给予非诺贝特（100μM）或罗格列酮（10μM）作用1 h,然后用10-7 M Ang II或PKC特异性激动剂佛波酯（PMA）刺激24 h,同法检测VSMCs中NF-κBp65蛋白表达。研究结果:1. Ang II体内对VSMCs中TLR4和炎性因子产生的影响及PPARα/γ激动剂的干预结果显示,模型组血清TNF-α升高,血浆6-keto-PGF1α降低（P<0.05）;主动脉VSMCs中TLR4、MMP-9蛋白和mRNA表达增强,PPARα、PPARγ蛋白和mRNA表达减少（P<0.05）。与模型组相比,非诺贝特和罗格列酮降低TNF-α含量,升高6-keto-PGF1α水平（P<0.05）,减少VSMCs中TLR4、MMP-9蛋白和mRNA表达（P<0.05）;非诺贝特增加PPARα蛋白和mRNA表达（P<0.001）,但对PPARγ蛋白和mRNA表达无明显影响（P>0.05）;罗格列酮增加PPARγ蛋白和mRNA表达（P<0.001）,但对PPARα蛋白和mRNA表达无明显影响（P>0.05）。2. Ang II体外对培养VSMCs中TLR4和炎性因子产生的影响及PPARα/γ激动剂的干预Ang II和LPS刺激VSMCs后,TNF-α剂量和时间依赖性升高,6-keto-PGF1α降低（P<0.01）。非诺贝特和罗格列酮剂量依赖性降低TNF-α,升高6-keto-PGF1α（ P<0.01）。Ang II和LPS刺激VSMCs后,TLR4、MMP-9蛋白和mRNA表达增加,PPARα、PPARγ蛋白和mRNA表达减少（P<0.05）。非诺贝特和罗格列酮均可减少TLR4和MMP-9蛋白及mRNA表达（P<0.05）,但非诺贝特仅可增加PPARα蛋白和mRNA表达（P<0.001）,罗格列酮仅可增加PPARγ蛋白和mRNA表达（P<0.001）。3. Ang II刺激VSMCs产生炎性因子的TLR4信号通路结果表明,阻断TLR4降低Ang II诱导的VSMCs中TNF-α（P<0.05）,升高6-keto-PGF1α（P<0.05）;抑制Ang II诱导的VSMCs中MMP-9蛋白和mRNA表达（P<0.05）,增加PPARα及PPARγ蛋白和mRNA表达（P<0.05）。losartan和PD098059明显抑制Ang II诱导的VSMCs中TLR4蛋白和mRNA表达（P<0.05）,而PD123319对此无明显影响,说明Ang II激活TLR4主要由AT1及随后的ERK1/2介导。Ang II增加VSMCs中IP-10蛋白和mRNA表达（P<0.01）,阻断TLR4减少Ang II诱导的VSMCs中IP-10表达（P<0.05）,说明IP-10可能位于TLR4致炎信号通路的下游。Ang II明显增加VSMCs中PKC蛋白和mRNA表达（P<0.001）,IP-10阻断剂减少Ang II诱导的VSMCs中PKC表达（P<0.01）,说明Ang II可能通过IP-10激活PKC而发挥致炎作用。Ang II增加VSMCs中NF-κBp65蛋白表达（P<0.001）,CH减少Ang II诱导的VSMCs中NF-κBp65表达（P<0.01）,说明Ang II可能通过PKC而激活NF-κB。4. PPARα/γ激动剂对Ang II致炎的TLR4信号通路的干预结果显示,Ang II和LPS明显升高VSMCs中TNF-α,降低6-keto-PGF1α（ P<0.001）;TLR4阻断剂、罗格列酮和非诺贝特均明显减少Ang II和LPS诱导的VSMCs中TNF-α（P<0.05）,升高6-keto-PGF1α（P<0.05）;而且罗格列酮和非诺贝特也可增强TLR4阻断剂的效应。TLR4阻断剂、罗格列酮和非诺贝特减少Ang II诱导的VSMCs中MMP-9蛋白表达（P<0.05）,但TLR4阻断剂增加PPARα和PPARγ蛋白表达（P<0.05）,非诺贝特增加PPARα蛋白表达（P<0.05）,罗格列酮促进PPARγ蛋白表达（P<0.05）,三者合用也有协同作用。TLR4 siRNA、非诺贝特和罗格列酮减少Ang II诱导的VSMCs中TNF-α产生（P<0.001）,增加6-keto-PGF1α释放（P<0.001）,抑制MMP-9 mRNA表达,但TLR4 siRNA几乎完全取消了非诺贝特和罗格列酮的效应。TLR4 siRNA也可取消Ang II减少VSMCs中PPARα和PPARγmRNA表达的效应（P<0.05）。在NC siRNA组,非诺贝特或罗格列酮单独上调VSMCs中PPARα或PPARγmRNA表达（P<0.05）,也可促进Ang II诱导的VSMCs中PPARα或PPARγmRNA表达（P<0.05）,但TLR4 siRNA并不改变非诺贝特或罗格列酮促PPARα或PPARγmRNA表达的效应。Losartan、PD098059、非诺贝特和罗格列酮均抑制Ang II诱导的VSMCs中TLR4蛋白表达（P<0.05）,但非诺贝特与losartan、PD098059合用无协同效应,而罗格列酮对losartan抑制TLR4蛋白表达无加强作用（P>0.05）,却可增强PD098059的阻断效应（P<0.05）。Ang II增强VSMCs中ERK1/2的磷酸化（P<0.001）,罗格列酮明显抑制这一效应（P<0.001）,但对未刺激细胞ERK1/2的磷酸化无明显影响。非诺贝特对Ang II刺激或未刺激的细胞ERK1/2磷酸化均无明显影响。Ang II刺激VSMCs后,AT1蛋白表达减少（P<0.05）,非诺贝特和罗格列酮对此无影响。TLR4 siRNA、非诺贝特和罗格列酮减少Ang II诱导的VSMCs中IP-10蛋白表达（P<0.05）,但TLR4 siRNA几乎完全取消非诺贝特和罗格列酮的抑制效应（P<0.05）。IP-10 siRNA、非诺贝特及罗格列酮明显抑制Ang II诱导的VSMCs中PKC蛋白表达（P<0.05）,但IP-10 siRNA可取消非诺贝特和罗格列酮的效应（P<0.05）。非诺贝特和罗格列酮明显下调Ang II和PMA诱导的VSMCs中NF-κBp65蛋白表达（P<0.05）,增强CH的抑制效应（P<0.01）。研究结论:1. Ang II体内外诱发大鼠VSMCs炎症反应及PPARα/γ激动剂的干预1)Ang II促进大鼠VSMCs中TNF-α产生,抑制6-keto-PGF1α释放。2)Ang II上调大鼠VSMCs中TLR4及MMP-9表达,下调PPARα及PPARγ表达。3)非诺贝特和罗格列酮通过减少Ang II诱导的大鼠VSMCs中TNF-α分泌、促进6-keto-PGF1α释放,调节促炎和抗炎之间平衡,发挥抗炎、抗As作用。4)非诺贝特和罗格列酮下调Ang II诱导的大鼠VSMCs中TLR4及MMP-9表达,上调PPARα或PPARγ表达,缓解炎症反应,遏制As的发生发展。2. Ang II通过TLR4依赖信号通路诱导VSMCs的炎症反应TLR4依赖的信号通路（AT1→ERK1/2→TLR4→IP-10→PKC→NF-κB）介导Ang II对VSMCs的致炎反应,这一发现不但有助于阐明Ang II新的致炎及致As机制,而且为As的药物防治提供了新的靶点和途径。3. PPARα/γ激动剂调控Ang II诱导的VSMCs炎症反应涉及TLR4依赖信号通路PPARα激动剂非诺贝特和PPARγ激动剂罗格列酮通过调控Ang II诱导的VSMCs中炎症因子产生,发挥抗炎及抗As作用。而这一作用的药理学基础与PPARα和PPARγ激活后干预TLR4依赖的致炎信号通路有关。因此,TLR4依赖的致炎信号通路有望成为PPARs激动剂防治As一个新的靶途径。