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本研究利用玻璃化冷冻技术保存体外成熟牛卵母细胞，以冷冻解冻后的存活率和发育能力作为冷冻效果的检测指标，希望找出能够在实践中应用的冷冻程序，并结合电镜切片观察分析了玻璃化冷冻对卵母细胞超微结构的影响。 第一部分：体外成熟牛卵母细胞玻璃化冷冻技术的研究 实验一：以相同浓度的EG、DMSO+EG、DMSO作为冷冻保护剂(vitrificationsolution，VS)进行细胞毒性检验，结果显示EG、DMSO+EG、DMSO处理组的卵母细胞存活率(87.2％、83.3％、79.8％)、囊胚率(10.0％、10.5％、6.3％)并没有显著差异，但EG、DMSO+EG处理组的卵裂率(78.8％、68.4％、)和8-细胞得率(33.8、31.6)都显著高于DMSO处理组(49.3％、16.5％)。但都显著低于对照组。 实验二：用M199+20％FCS中加入10％DMSO+10％EG作为VS1，M199+20％FCS中加入20％DMSO+20％EG+0.25Msuc作为VS2，在VS1中停留60秒后再移入VS2中分别停留不同的时间：30、40、50、60、70秒，冷冻结果各组卵母细胞的存活率分别是：7.1％、33.3％、70.2％、80％、87.5％；卵裂率分别为：0％、40.0％、50.0％、20.8％、17.1％；囊胚率分别是：0％、0％、7.5％、2.1％、0％。结果显示在VS1中平衡60秒时在VS2中停留50秒效果明显好于其他组，但显著低于对照组。 实验三：在卵母细胞体外成熟22小时后去掉部分卵丘进行冷冻，在VS1中平衡60秒，在VS2中分别平衡20、30、40、50、60秒，然后进行冷冻处理， 内蒙古大学硕i学位论文结果表明在VSZ中平衡30秒为最佳时间。在VSZ中平衡30秒，在VSI中分别平衡30、60、90秒，进行冷冻处理，结果在VSI中平衡30秒为最佳时间。 实验四:在体外成熟O、6、12、22小时用吸管轻轻吹打去掉部分卵丘，然后继续培养到成熟后进行冷冻，冷冻结果卵裂率分别是40.2%、47.5%、39.1%、43.9%;囊胚率分别是4.1%、6.3%、6.3%、6.8%。结果显示各组之间并无显著差异。 实验五:分别用三种不同的冷冻方法(OPS、cry。1。叩、mini--drop)冷冻保存卵母细胞，结果显示三种不同的方法冷冻卵母细胞的存活率分别是:78.9%、84.2%、72.6%;卵裂率分别为:44.4%、46.3%、48.2%;囊胚率分别是:6.7%、7.5%、5.9%。结果显示各组之间并无显著差异，但是用cryoloop(76.6%)和mini一drop(76.5%)的卵母细胞回收率与OPS(95.0%)法有显著差异。 实验六:分别用一步法、二步法和三步法进行卵母细胞的解冻，各组卵母细胞的卵裂率分别为:19.5%、43.9%、44.2%;囊胚率分别是:既、5.3%、4.7%。一步法和二步法、三步法相比有显著差异，二步法和三步法之间并无明显差别。第二部分:冷冻后卵母细胞及其受精发育后二细胞超微结构的观察 用M199+20%FCS中加入10%DMSO+10%EG作为VSI，M199+20%FCS中加入20%DMSO+20%EG+0 .25Msuc作为VSZ，在冷冻液l和冷冻液2中平衡30秒，用ops法冷冻，用两步解冻法进行解冻，用电镜观察冷冻后卵母细胞及其受精发育后二细胞超微结构。结果显示冷冻导致卵母细胞的微绒毛、皮质颗粒发生了改变，但冷冻并不影响卵母细胞线粒体、空泡和脂滴的结构。