论文部分内容阅读
本研究利用玻璃化冷冻技术保存体外成熟牛卵母细胞,以冷冻解冻后的存活率和发育能力作为冷冻效果的检测指标,希望找出能够在实践中应用的冷冻程序,并结合电镜切片观察分析了玻璃化冷冻对卵母细胞超微结构的影响。 第一部分:体外成熟牛卵母细胞玻璃化冷冻技术的研究 实验一:以相同浓度的EG、DMSO+EG、DMSO作为冷冻保护剂(vitrificationsolution,VS)进行细胞毒性检验,结果显示EG、DMSO+EG、DMSO处理组的卵母细胞存活率(87.2%、83.3%、79.8%)、囊胚率(10.0%、10.5%、6.3%)并没有显著差异,但EG、DMSO+EG处理组的卵裂率(78.8%、68.4%、)和8-细胞得率(33.8、31.6)都显著高于DMSO处理组(49.3%、16.5%)。但都显著低于对照组。 实验二:用M199+20%FCS中加入10%DMSO+10%EG作为VS1,M199+20%FCS中加入20%DMSO+20%EG+0.25Msuc作为VS2,在VS1中停留60秒后再移入VS2中分别停留不同的时间:30、40、50、60、70秒,冷冻结果各组卵母细胞的存活率分别是:7.1%、33.3%、70.2%、80%、87.5%;卵裂率分别为:0%、40.0%、50.0%、20.8%、17.1%;囊胚率分别是:0%、0%、7.5%、2.1%、0%。结果显示在VS1中平衡60秒时在VS2中停留50秒效果明显好于其他组,但显著低于对照组。 实验三:在卵母细胞体外成熟22小时后去掉部分卵丘进行冷冻,在VS1中平衡60秒,在VS2中分别平衡20、30、40、50、60秒,然后进行冷冻处理, 内蒙古大学硕i学位论文结果表明在VSZ中平衡30秒为最佳时间。在VSZ中平衡30秒,在VSI中分别平衡30、60、90秒,进行冷冻处理,结果在VSI中平衡30秒为最佳时间。 实验四:在体外成熟O、6、12、22小时用吸管轻轻吹打去掉部分卵丘,然后继续培养到成熟后进行冷冻,冷冻结果卵裂率分别是40.2%、47.5%、39.1%、43.9%;囊胚率分别是4.1%、6.3%、6.3%、6.8%。结果显示各组之间并无显著差异。 实验五:分别用三种不同的冷冻方法(OPS、cry。1。叩、mini--drop)冷冻保存卵母细胞,结果显示三种不同的方法冷冻卵母细胞的存活率分别是:78.9%、84.2%、72.6%;卵裂率分别为:44.4%、46.3%、48.2%;囊胚率分别是:6.7%、7.5%、5.9%。结果显示各组之间并无显著差异,但是用cryoloop(76.6%)和mini一drop(76.5%)的卵母细胞回收率与OPS(95.0%)法有显著差异。 实验六:分别用一步法、二步法和三步法进行卵母细胞的解冻,各组卵母细胞的卵裂率分别为:19.5%、43.9%、44.2%;囊胚率分别是:既、5.3%、4.7%。一步法和二步法、三步法相比有显著差异,二步法和三步法之间并无明显差别。第二部分:冷冻后卵母细胞及其受精发育后二细胞超微结构的观察 用M199+20%FCS中加入10%DMSO+10%EG作为VSI,M199+20%FCS中加入20%DMSO+20%EG+0 .25Msuc作为VSZ,在冷冻液l和冷冻液2中平衡30秒,用ops法冷冻,用两步解冻法进行解冻,用电镜观察冷冻后卵母细胞及其受精发育后二细胞超微结构。结果显示冷冻导致卵母细胞的微绒毛、皮质颗粒发生了改变,但冷冻并不影响卵母细胞线粒体、空泡和脂滴的结构。