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阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种与年龄直接相关的神经系统退行性疾病,其病因及发病的分子机制目前还不完全清楚,目前的治疗方法只能改善症状,延缓病情进展。神经干细胞的发现为AD的治疗提供了新的思路。有效激活内源性神经干细胞和采用外源性干细胞移植以替代和修复受损的神经元是治疗AD的两大策略。但干细胞在体内生长和体外培养的过程中都会出现衰老现象,进而导致衰老相关疾病的发生和干细胞的应用受限。Wnt/β-catenin信号通路在胚胎生长发育中起着至关重要的作用。报道显示激活Wnt/β-catenin信号通路可以促进干细胞向神经细胞分化,调节体内海马部位的神经发生。研究发现间充质干细胞对阿尔茨海默鼠海马神经发生和神经分化的促进作用可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路实现的。氯化锂(lithium chloride,Li Cl)作为治疗双相性情感障碍最重要的药物,应用于临床已有100余年的历史,其安全性和有效性已得到有效证实。同时,Li Cl是Wnt/β-catenin信号通路的关键蛋白糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)的直接抑制剂,可以使β-catenin在细胞核内聚集,从而激活Wnt/β-catenin通路。研究发现Li Cl可以改善阿尔茨海默鼠的空间记忆能力和神经退行性病变。而Li Cl联合干细胞对阿尔茨海默病的治疗作用目前尚未见报道。目的因此,本课题以Li Cl为靶点,以人脐带来源的间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,h UC-MSCs)为对象,体外观察Li Cl对h UC-MSCs增殖、衰老、凋亡以及神经分化能力的影响,然后通过体内实验评价Li Cl联合h UC-MSCs对AD鼠的神经修复和干预作用,并初步探讨其可能的分子机制,以期提高干细胞对AD的治疗效果,为AD的治疗提供理论依据。方法1、体外实验研究Li Cl对h UC-MSCs增殖、衰老和神经分化的影响实验分为2组:对照组(MSCs组)和Li Cl处理组(MSCs+Li Cl组)。CCK-8实验和Ed U染色法检测Li Cl对h UC-MSCs增殖的影响;流式细胞术检测Li Cl对h UC-MSCs周期和凋亡的影响;β-半乳糖苷酶染色法检测Li Cl对h UC-MSCs衰老的影响;q RT-PCR和Western Blot检测Li Cl对h UC-MSCs中衰老相关基因在m RNA和蛋白水平表达的影响;细胞免疫荧光法检测神经诱导分化后NSE、DCX、β-III Tubulin的表达情况;q RT-PCR检测神经诱导分化后Ngn1、Ngn2、Mash1的表达情况。2、体内实验分析Li Cl联合h UC-MSCs移植对AD鼠的干预作用取60只4月龄AD模型鼠(APP695v717转基因小鼠),分为6组:对照组(APP-组),AD模型组(APP+组)、Li Cl腹腔注射组(Li Cl组)、h UC-MSCs移植组(MSCs组)、Li Cl预处理h UC-MSCs移植组(Li Cl预组)Li Cl联合h UC-MSCs移植组(Li Cl+MSCs组)。Morris水迷宫法检测小鼠的学习记忆能力;取出小鼠脑组织做石蜡切片,免疫组化检测脑内h UC-MSCs的存活和迁移,分析脑内神经元标记物β-III Tubulin的表达,以及磷酸化tau蛋白的变化情况;分离小鼠海马组织,q RT-PCR、Western Blot检测海马组织中Wnt/β-catenin通路相关基因以及衰老相关基因的表达情况,q RT-PCR检测海马组织内神经营养因子BDNF、NGF、NT3的表达变化。结果1、与对照组相比,Li Cl处理可以明显促进h UC-MSCs的增殖,增加处于S期的细胞比例、降低凋亡细胞比率和β-半乳糖苷酶阳性细胞比例(P<0.05)。进一步研究发现Li Cl可以降低h UC-MSCs中GSK-3β、p16、p21和p53在m RNA和蛋白水平的表达,增加c-Myc、p CNA、sirt1和sirt2在m RNA和蛋白水平的表达,而仅仅增加β-catenin蛋白的表达(P均<0.05)。与h UC-MSCs相比,神经诱导分化后细胞胞体明显回缩,多数细胞可见树突及轴突长出;诱导分化组中NSE、DCX、β-III Tubulin、Ngn2、Mash1的表达明显增加(P<0.05),而与单纯诱导组相比,Li Cl处理组的各评价指标均有增加(P<0.05)。2、与APP+组相比,h UC-MSCs移植和Li Cl腹腔注射均能明显改善小鼠的学习记忆功能,二者联合时效果更佳(P<0.05)。与MSCs组相比,Li Cl+MSCs组海马内h UC-MSCs的存活明显增加(P<0.05)。各治疗组海马组织中衰老相关基因p16、p21、p53在m RNA和蛋白水平的表达均明显下降,p CNA、sirt1、sirt2在m RNA和蛋白水平的表达明显增加;其中,联合治疗组sirt1在m RNA和蛋白水平表达明显高于单一治疗组(P<0.05)。各治疗组Wnt/β-catenin信号通路相关基因GSK-3β均有下降、β-catenin、c-Myc均有升高,且c-Myc在联合治疗组升高更加明显(P<0.05)。各治疗组β-III Tubulin、BDNF、NGF、NT3的表达均明显增加(P<0.05),其中联合治疗组增加最为明显(P<0.05)。结论1、Li Cl可通过激活Wnt/β-catenin信号通路和调控h UC-MSCs中衰老相关基因的表达促进h UC-MSCs的增殖,抑制h UC-MSCs的凋亡与衰老,促进h UC-MSCs的神经分化,进而增加干细胞的活性。2、Li Cl通过增加h UC-MSCs的迁移存活和在损伤部位的神经分化能力,明显改善h UC-MSCs移植后AD鼠的学习和记忆能力,提高海马内神经营养因子的表达,进而延缓AD鼠的衰老。且Li Cl与h UC-MSCs联合治疗的效果明显优于单一治疗的效果。