MicroRNAs(miRNAs)是多种真核生物内源编码的一类参与RNA干扰现象的小RNA分子,作为重要的转录后调控因子miRNA在动物,植物及病毒等许多物种的转录后基因沉默效应(post-transcriptional gene silencing,PTGS)中发挥关键作用。它们通过与靶mRNA完全或不完全互补以多种不同机制调控一个或是多个目的基因的表达,从而在系统发育及疾病发生等多种生物学过程中扮演重要角色。　　 病毒miRNA是病毒感染过程中产生的具有RNA干扰效果的一类分子。首个病毒miRNA是2004年在疱疹病毒家族发现的,其功能是调节病毒mRNA的转录。此后,在诸多DNA病毒中均有miRNA报道,它们通常靶向病毒mRNA以调节病毒蛋白的表达。由于分子较小,miRNA成为病毒用以抵抗宿主防御的理想策略。目前有研究报道部分miRNA还可通过干扰宿主细胞基因来重塑细胞内环境。例如,Kaposi肉瘤相关疱疹病毒KSHV可以利用病毒miRNA分子调节细胞基因的转录。　　 本课题围绕病毒编码的miRNA分子hsv-miR-P2及其细胞内靶基因在病毒与宿主相互作用中的分子机制及生物学功能开展研究。hsv-miR-P2是我们前期预测并验证的在HSV-1感染过程中产生的一个病毒miRNA分子,它位于Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1)立即早期基因ICP0的非编码区。利用靶基因预测软件miRanda及序列分析对hsv-miR-P2的靶基因进行生物信息学分析,结果表明hsv-miR-P2的靶基因很可能是宿主细胞基因kelch like-24(KLHL24)。　　 我们首先检测产生hsv-miR-P2的病毒HSV-1感染细胞时对靶基因KLHL24的影响。对感染细胞的检测发现,病毒感染下调了miRNA靶基因KLHL24的表达水平均。为进一步确认hsv-miR-P2的作用靶位点,即KLHL243’UTR受miRNA的调控,我们构建了一个细胞水平检测的报告基因系统:它包含一个miRNA表达载体以及一个含有靶位点的报告质粒。首先模拟细胞内基因结构将KLHL243’UTR区构建至含报告基因GFP的载体中,再利用高效稳定表达的hsv-miR-P2对报告基因表达影响进行分析。流式细胞仪检测结果表明hsv-miR-P2能够特异的降低带有KLHL243’UTR区报告基因GFP的荧光强度。利用miRNA抑制剂2-O-me-anti—miR—P2敲低hsv-miR-P2的表达后,发现抑制剂能够拮抗miRNA对报告基因GFP的抑制作用。实验结果表明KLHL243’UTR受hsv-miR-P2的特异性调控。　　 宿主细胞基因KLHL24编码一个未知功能蛋白KEL,我们通过免疫荧光实验发现该蛋白定位于细胞核中,为了检测KEL蛋白在细胞中的生物学功能,我们上调KEL水平发现它能够抑制HSV-1病毒立早,早期及晚期基因mRNA的表达。利用氯霉素乙酰转移酶CAT系统对病毒启动子区的检测显示,在转染pcDNA3-KEL的CAT分析系统中HSV-1早期基因TK及晚期基因gC的启动子受KEL蛋白的转录抑制调控。并且可观察到KEL蛋白还能抑制细胞中常见的启动子近侧序列元件(Promoter proximal sequence elements,PSE)CAAT,ATF,SP1的转录效率。同时利用RNA干扰技术敲低细胞中KEL蛋白表达水平,能够增加HSV-1病毒滴度。结果显示,hsv-miR-P2靶基因KLHL24编码KEL在细胞中是一个具有转录调控作用的蛋白,并且对HSV-1病毒的复制增殖具有转录抑制作用。　　 为了进一步验证hsv-miR-P2在病毒感染水平的影响,我们利用抑制剂2-O-me-anti-miR-P2敲低病毒hsv-miR-P2的表达水平,检测发现HSV-1多种病毒基因的转录效率均受到抑制。同时滴度实验也表明hsv-miR-P2敲低的细胞中病毒滴度较对照组降低。结果提示HSV-1编码miRNA分子hsv-miR-P2在病毒复制增殖中发挥调控作用,并促进病毒感染的进程。　　 通过以上研究,我们发现细胞基因KLHL24 mRNA3’UTR区是病毒编码miRNA hsv-miR-P2的特异性调控位点,且靶基因的表达水平受hsv-miR-P2的下调。KLHL24编码蛋白KEL作为细胞中的转录调控因子,对病毒复制增殖具有抑制作用。HSV-1感染时,病毒利用自身编码的miRNA分子通过RNA干扰的机制下调细胞中的抗病毒因子KEL的表达,从而达到提高病毒感染效率的目的。我们的工作为病毒通过miRNA转录调控水平对细胞的防御体系进行调节的理论提供了直接证据,并且进一步加深了对病毒感染策略中分子生物学机制的了解。