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目的:食管癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一，我国是食管癌高发区。食管癌早期缺乏特异临床表现，大部分食管癌患者就诊时已经属于晚期，近年来虽然手术及放射、化学疗法在食管癌治疗方面取得了一定的进步，但是5年总体生存率仍然低于20％。食管癌细胞增殖、转移是影响患者疗效和预后的重要因素，也是当前食管癌研究中最重要的一个方面。蛋白酶激活受体-2(Proteinase-actived receptors2，PAR-2)属于细胞膜表面受体，是与G蛋白相耦联的蛋白酶激活受体超家族成员，胰蛋白酶、类胰蛋白酶、凝血因子等是该受体的天然激动剂，PAR-2受激活后可引起一系列关于肿瘤侵袭、转移、增殖生长等方面的生物学行为。我们的前期研究发现食管癌细胞EC109表达PAR-2，PAR-2激活后可使基质金属蛋白酶分泌增加，从而促进EC109细胞的运动、侵袭能力。RNA干扰(RNAi)是由小分子干扰RNA(siRNA)介导的一种转录后基因沉默技术，siRNA通过与靶mRNA特异性互补配对，引起靶mRNA降解或抑制其翻译，从而使靶基因表达抑制。RNA干扰因其对靶基因的沉默具有高度的特异性和强大的抑制作用，正越来越多地应用于多种疾病的预防和治疗研究。本实验通过PAR-2基因靶向shRNA表达质粒转染食管癌EC109细胞，建立PAR-2基因沉默的稳定细胞株，进而来研究PAR-2基因沉默对食管癌EC109细胞增殖和侵袭迁移能力的影响。
方法:针对人PAR-2的mRNA序列，设计并体外合成编码shRNA的两条特异性寡核苷酸序列，分别插入pGFP-V-RS质粒载体中构建两个shRNA表达质粒(PAR-2 shRNA-1、PAR-2 shRNA-2)，经过鉴定，然后将表达质粒转染至食管癌细胞EC109中，经嘌呤霉素筛选，获得稳定干扰的细胞株，运用RT-PCR和Western Blot法检测PAR-2的表达，从而筛选出最佳干扰序列的稳定细胞株PAR-2 shRNA EC109;运用MTT及流式细胞术法检测PAR-2 shRNA EC109细胞增殖能力及细胞周期的变化;Transwell小室法检测PAR-2基因沉默前后细胞侵袭和迁移能力的变化。
结果:
1.构建PAR-2基因靶向shRNA表达质粒并测序鉴定成功构建了PAR-2基因靶向shRNA表达质粒，质粒测序鉴定结果显示重组质粒PAR-2 shRNA-1、PAR-2 shRNA-2与设计的靶向PAR-2的寡核苷酸序列比较完全一致。
2.通过RNAi技术成功筛选出了PAR-2基因表达下调的食管癌PAR-2shRNA EC109稳定细胞株
2.1 重组质粒转染EC109细胞的RT-PCR结果显示PAR-2 shRNA-1组、PAR-2shRNA-2组、非特异性序列转染组和空白对照组，四组吸光度的比值分别为0.35±0.03、0.43±0.04、0.44±0.04、0.45±0.41。PAR-2 shRNA-1组PAR-2mRNA相对表达显著降低，与另外三组比较差异有显著意义(P＜0.05)。PAR-2 shRNA-2组、非特异性序列转染组和空白对照组三组间PAR-2mRNA相对表达差异无显著性(P＞0.05)。
2.2 重组质粒转染EC109细胞的Western-Blot结果显示四组灰度比值分别为0.96±0.01、1.04±0.02、1.05±0.04、1.09±0.04。PAR-2 shRNA-1组PAR-2蛋白的表达明显减少，与另外三组相比差异有显著意义(P＜0.05)。而PAR-2shRNA-2组、非特异性序列转染组和空白对照组三组间PAR-2蛋白表达差异无显著性(P＞0.05)。
3.MTT法检测PAR-2shRNAEC109细胞的增殖活性，显示PAR-2shRNAEC109细胞增殖低于正常对照组，24、48、72小时的细胞抑制率分别为:15.92％、24.89％、32.28％，与正常对照组比较差异有显著性(P＜0.05)，而转染试剂组和阴性质粒转染组与正常对照组比较无明显差异(P＞0.05)。
4.流式细胞术检测PAR-2shRNAEC109细胞周期变化，显示PAR-2shRNAEC109细胞发生S期阻滞，转染24、48、72小时S期细胞比例分别为(32.79±4.06)％、(26.54±1.37)％和(33.45±2.46)％，与对照组相比差异有显著性(P＜0.05)。
5.Transwell小室法检测PAR-2基因沉默前后细胞侵袭和迁移能力
5.1 在侵袭实验中，PAR-2 shRNA EC109细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数为19.6±2.11(200×)，与对照组比较差异有显著性(P＜0.05)。
5.2 在迁移实验中，PAR-2 shRNA EC109细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数为24.2±2.82(200×)，与对照组比较差异有显著性(P＜0.01)。
结论;
1.成功构建靶向PAR-2基因的shRNA表达质粒，转染食管癌细胞EC109，能有效抑制该细胞株PAR-2mRNA和蛋白的表达;成功获得PAR-2基因下调的人食管癌稳定细胞株PAR-2 shRNA EC109。
2.PAR-2 shRNA EC109细胞发生S期阻滞，细胞的增殖减慢。
3.PAR-2 shRNA EC109细胞的侵袭及迁移能力降低。