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植物非特异性转脂蛋白(nsLTP)是一类广泛存在于高等植物中的碱性小分子蛋白。早期体外试验发现,它们能与脂肪酸结合,并增强膜结构之间的脂分子转移。后来的研究表明,转脂蛋白参与了植物角质层的形成,以及针对生物和非生物胁迫的应答等生理过程。目前,其准确的生物学功能仍在争论之中,有关转脂蛋白功能调节的信息更是缺乏。
本文以拟南芥为实验材料,研究了BP10在体内参与植物的生物与非生物胁迫反应,同时探讨了钙调素参与转脂蛋白功能的调节。首先,为了确定BP10的体内功能,进一步了解其在植物应对生物与非生物胁迫中的作用,分别用外源SA、ABA、JA、JA与LTP混合物以及真菌激发子处理白菜幼苗,以半定量RT-PCR法分析对内源BP10表达的影响。同时,对白菜幼苗进行高盐和干旱处理,进一步探讨BP10对逆境胁迫的应答。实验结果显示以上处理均能引起BP10不同程度的表达上调,初步说明BP10在体内作为LTP参与了防卫功能和对环境胁迫的应答反应。其中JA与BP10混合物对内源BP10表达的影响明显高于单独用JA或LTP处理,这与Buhot等报道的LTPs作为信号分子参与了植物抗性信号转导并且LTP-JA是LTPs的生物活性形式的报道相吻合。其次,构建BP10和BP10的钙调素结合缺失突变体(4ABP10)的双元载体,采用冻融法转入到农杆菌GV3101中,然后用浸花法转化拟南芥,收集拟南芥种子并在有Kan抗性的培养基上筛选转化的植株,并通过PCR和RT-PCR的方法进一步验证转化植株。通过对转基因拟南芥整个生长周期的观察,没有明显表型的变化。因此进一步对转基因拟南芥生物和非生物的抗性研究来确定BP10的体内功能。对转基因拟南芥在幼苗期和成苗期分别做抗性研究,结果显示BP10转基因拟南芥在整个生长周期中的盐,旱和真菌抗性都明显高于野生型的拟南芥,实验证明了BP10参与了植物对生物与非生物的抗性反应,并且发挥了重要的作用。但是,BP10的钙调素结合缺失突变体的转基因拟南芥在整个生长周期中的抗性与野生型的拟南芥没有太大的区别,本结果的说明了BP10在体内参与抗性功能是受钙调素调节的,为进一步探索转脂蛋白在植物体内的作用机制提供了新的线索。克隆了与BP10同源性很高的拟南芥nsLTP1,并且构建了此基因的反义载体,同样通过浸花法转入到野生型的拟南芥中,目的是通过antisense的方法沉默掉拟南芥中的nsLTP1。对此转基因拟南芥进行不同生长周期的抗性研究,结果显示抗性明显低于野生型的拟南芥,此结果进一步证明了nsLTP参与了植物的生物与非生物胁迫的抗性功能。