前言特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)病因与发病机制尚不清楚,可能是遗传因素、免疫因素、有缺陷的皮肤屏障功能以及环境因素共同作用的结果。神经免疫因素及皮肤屏障功能障碍在AD发病机制中的作用是目前研究的热点。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是神经营养因子(neurotrophins,NTs)家族成员之一,除了具有营养神经作用外,也是炎症反应过程中免疫细胞与神经细胞间的重要调节成分。BDNF在AD发病过程中扮演重要的角色。BDNF血清水平与AD患者的疾病活动性、严重性及生活质量相关。BDNF能够诱导AD患者外周血嗜酸性粒细胞趋化、抑制其凋亡;抑制单个核细胞Th1型细胞因子IFN-γ及IL-12的产生,对Th2型细胞因子IL-4、IL-10和IL-13的产生没有影响,进而导致Th1/Th2型细胞因子平衡紊乱、增加抗原特异性IgE的产生。BDNF基因定位于11号染色体短臂11p13,存在多种基因变异和基因多态性,C270T及G196A多态性的研究倍受关注。最近欧洲有少数BDNF基因C270T及G196A多态性与变应性疾病相关性的研究报道,目前尚无AD与BDNF基因多态性在中国人群中的研究报道。角质形成细胞不仅是构成体表的屏障,同时也是一种重要的免疫细胞,可分泌多种细胞因子、表达相应细胞因子受体。源自角质形成细胞的细胞因子可以影响炎症细胞的迁移、角质形成细胞本身的增生和分化,也可增强或减弱其它细胞因子的分泌,并辅助T细胞免疫应答,甚至对全身免疫机能也有重要作用。角质形成细胞表达BDNF受体TrkB,并发生TrkB样免疫反应。BDNF已被证实调控角质形成细胞的增殖反应,维持表皮内环境的稳定;但BDNF如何调节角质形成细胞分泌免疫调节型细胞因子、参与皮肤变应性炎症反应尚需进一步研究。丝聚合蛋白是存在于人表皮角质形成细胞内的一种易溶于水的蛋白,其生成的天然保湿因子(natural moisturizing factor,NMF)对保持皮肤的水合作用及屏障功能至关重要。丝聚合蛋白基因(filaggrin,FLG)位于人类染色体1q21.3区,是表皮分化复合物基因簇的成员之一,与细胞膜形成及表皮终末分化密切相关。FLG基因突变引起的皮肤屏障功能障碍在AD发病中扮演着重要角色,丝聚合蛋白的减少和缺失,可能是引起AD等干燥性皮肤病的主要原因。R501X无义突变与2282del4移码突变是欧洲AD人群FLG基因的主要突变位点;然而,FLG基因突变具有种族及地域差别,在亚洲及非洲AD人群中,并未见R501X及2282del4突变。在日本AD人群中,S2554X无义突变与3321delA移码突变为主要突变位点;但在欧洲AD人群中,未见S2554X与3321delA突变。目前尚无FLG基因突变在中国AD人群的研究报道。本研究采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chainreaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)结合测序(DNAsequencing)的方法检测BDN F基因C270T、G196A位点多态性以及FLG基因E2422X、Q2417X、S2554X、S2889X、S3296X、R4307X无义突变和7945delA移码突变在中国AD人群的分布,从分子遗传学角度探讨AD的发病机制。同时,我们采用Real-time RT-PCR及ELISA方法检测BDNF对表皮HaCaT细胞分泌免疫调节型细胞因子IL-10、IL-6、IL-12及IFN-γ的影响,以探讨BDNF介导变应性炎症反应的可能机制及BDNF在AD皮损局部细胞因子网络中可能发挥的作用。材料和方法一、研究对象1、病例组181例AD患者,符合Williams诊断标准。男性96例,女性85例,平均年龄12.9±13.7岁。入选患者均处于疾病活动期,采用SCORAD评分确定疾病的严重程度。所有患者均为辽宁籍汉族人,彼此间无血缘关系,于就诊前6个月未使用糖皮质激素及免疫抑制剂。2、正常对照组197例健康志愿者,男性103例,女性94例,平均年龄31.5±9.4岁。已排除有过敏性哮喘、过敏性鼻炎及荨麻疹、湿疹、枯草热等异位性表现者,辽宁籍汉族人,彼此间无血缘关系。以上两组研究对象均已排除精神、神经系统疾患,体重指数正常范围内,签署知情同意书。3、HaCaT角质形成细胞株二、实验材料EDTA、氯仿、异丙醇、无水乙醇、2×Taq Plus Master-Mix聚合酶、琼脂糖、8%非变性聚丙烯酰胺溶液、限制性内切酶HinfⅠ、Ecol 72Ⅰ、NlaⅢ、BfaⅠ、Hpy188Ⅰ、BamHI、DpnⅡ、DdeⅠ、RPMI1640细胞培养液、青链霉素溶液、胰蛋白酶、PBS、DEPC、RealMasterMix。三、实验方法1、应用PCR-RFLP方法对BDNF基因C270T、G196A等位基因进行分型。2、应用Real-time RT-PCR及ELISA方法检测不同浓度BDNF对HaCaT细胞分泌免疫调节型细胞因子IL-10、IL-6、IL-12及IFN-γ的影响。3、应用PCR-RFLP结合测序的方法,对FLG基因E2422X、Q2417X、S2554X、S2889X、S3296X、R4307X无义突变及7945delA移码突变进行检测。四、统计学分析所有统计学分析过程均采用SPSS13.0软件完成。统计方法主要包括x~2检验、单因素方差分析等,P＜0.05即具有统计学意义。Hardy-Weinberg平衡吻合性检验、组间基因型频率及等位基因频率的差异性比较采用x~2检验,并以优势比(odds ratio,OR)及其95%可信区间(confidende interval,CI)表示相对危险度。结果1、特应性皮炎与脑源性神经营养因子基因C270T及G196A多态性相关性分析(1)AD组和正常对照人群BDNF基因C270T和G196A基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。(2)BDNF基因C270T位点T等位基因在AD组和正常对照组间分布有显著性差异(OR=3.130,95%CI1.116～8.778)。(3)BDNF基因C270T位点T等位基因在男性AD和正常对照组间分布有显著性差异(OR=4.1 12,95%CI:1.129～14.973)。(4)BDNF基因C270T位点T等位基因在内源性AD和外源性AD组间分布有显著性差异(OR=3.554,95%CI:1.165～10.844)。(5)BDNF基因G196A位点A等位基因在是否伴有一级亲属异位史AD组间分布有显著性差异(OR=1.579,95%CI:1.021～2.442)。2、脑源性神经营养因子对角质形成细胞分泌细胞因子影响的研究(1)不同浓度BDNF作用24小时后,HaCaT细胞IL-10mRNA表达量及培养液上清中IL-10表达水平在0.1ng/mlBDNF组与0ng/mlBDNF组间无明显变化,1ng/mlBDNF组及10ng/mlBDNF组IL-10表达水平与0ng/mlBDNF组及0.1ng/mlBDNF组间差异均具有统计学意义,且表达水平随BDNF浓度增加而升高。(2)不同浓度BDNF作用24h后,0.1ng/mlBDNF组、1ng/mlBDNF组及10ng/mlBDNF组HaCaT细胞IL-12mRNA表达量与0ng/mlBDNF组间均有显著性差异,且随BDNF浓度的增加而减少;培养液上清中IL-12表达水平在0.1ng/mlBDNF组与0ng/mlBDNF组间比较无明显变化,1ng/mlBDNF组及10ng/mlBDNF组IL-12的表达水平与0ng/mlBDNF组及0.1ng/mlBDNF组间差异均具有统计学意义,且表达水平随BDNF浓度增加而降低。3、特应性皮炎与丝聚合蛋白基因突变的相关性研究AD组及正常对照组FLG基因E2422X、Q2417X、S2554X、S2889X、S3296X、R4307X无义突变及7945delA移码突变的突变率均为0。结论1、BDNF基因C270T位点多态性与AD的发生有关,携带T等位基因的男性及内源AD患者发病的危险性均明显增加。2、BDNF基因G196A位点基因型及等位基因在是否伴有一级亲属异位史AD组间分布具有显著性差异,携带A等位基因的伴有一级亲属异位史的AD患者发病的危险性增加。3、HaCaT细胞经不同浓度BDNF作用后,IL-10mRNA的表达量及培养液上清中IL-10表达水平随BDNF作用浓度的增加呈剂量依赖性升高;IL-12mRNA的表达量及培养液上清中IL-12表达水平随BDNF作用浓度的增加呈剂量依赖性降低。BDNF可能通过调节角质形成细胞分泌不同的免疫调节型细胞因子,改变局部细胞因子环境,在AD患者Th1/Th2型细胞因子平衡紊乱中发挥作用。4、中国东北地区FLG基因E2422X,Q2417X,S2554X,S2889X,S3296X,R4307X及7945delA位点基因型保守,均为野生型。FLG基因突变存在明显的种族及地域区别。