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橘小实蝇,Bactrocera dorsalis(Hendel),作为一种东南亚普遍存在的毁灭性害虫,能危害超过250种水果蔬菜,造成严重的经济损失。相对于化学农药防治,雄性不育技术(Sterile insect technique,SIT)防治橘小实蝇具有特异性高、环境友好的显著优势。传统的SIT方法通过辐射或化学不育剂实现,但由于其降低雄虫交配能力、生存力、免疫力等生物性能而限制了害虫防控效果。近期出现的基于遗传干扰技术(例如RNA interference(RNAi))的SIT却展现出巨大的害虫防治应用潜力。RNAi是一种由ds RNA启动的保守基因表达抑制机制,已成功应用于功能基因组、医药、农业,以及害虫防控研究领域。虽然RNAi技术已经在众多农业害虫中成功实现,但在田间实际应用之前仍需要克服诸多使用技术问题。为了开发基于RNAi的SIT技术用于防控橘小实蝇,本研究首先筛选了精子形成关键基因,并验证了其RNAi的雄性不育效果。为了进一步提高ds RNA稳定性和干扰效果,本研究开发了关键基因(Boul)的ds RNA的纳米颗粒包装技术,筛选出最佳的物质配比和p H值条件,并验证其对基于RNAi的雄性不育技术的改进效果。最后,我们应用Sf9细胞系在细胞水平上研究了最佳制备条件(p H=6.5,Chitosan:ds RNA=1:4)下纳米材料包装的ds Boul对昆虫细胞的影响。1.诱导橘小实蝇雄虫不育的RNAi靶标基因第一部分研究中,我们通过RNA干扰橘小实蝇雄虫候选生殖细胞分化和精子缺失相关基因,再检测其与正常雌虫交配产卵等繁殖力,研究筛选了诱导雄虫不育的RNAi靶标基因。结果表明在喂食ds RNA处理后,橘小实蝇雄虫中靶基因(Boul,ZPG,dsxM,FZO and Gas8)的表达水平显著降低,并严重影响雄性的生殖能力,与对照组(ds Egfp)相比,卵孵化率降低60%-75%。不同基因ds RNA进行不同组合(Boul+ZPG,Boul+dsxM and ZPG+dsxM)干扰试验表明,发现其RNAi可以进一步提升雄性不育效果,其中最佳组合Boul+ZPG可造成86%的雄性不育。最佳的Boul+ZPG ds RNA组合不同使用浓度试验结果表明250,500,750和1000 ng/ul分别造成了20.1%,39.63%,59.24%和86.28%的雄性不育;不同日龄的雄虫RNAi处理后表明1、5、7、10日龄雄虫的不育比例分别为86.28%,34.14%,22.60%和10.83%。这些结果表明在最佳ds RNA组合下进行RNAi,可显著减少雄虫的精子和活精子的数量。我们的研究有助于在B.dorsalis中发展基于RNAi的新型SIT技术用于防控橘小实蝇。2.橘小实蝇dsboul壳聚糖纳米颗粒包装释放技术在第二部分研究中,我们进一步开发了ds RNA的纳米颗粒包装释放技术。针对雄性不育效果最好的Boul基因,我们比较了两种纳米颗粒制备方法:1)嵌入法,2)吸收法;同时比较了三种p H值(6.5,7.5和8.5)条件。q RT-PCR结果表明,p H的变化可以显著影响ds Boul的RNAi效率。RNAi处理后持续25d的观察结果表明在p H=6.5条件下嵌入法制备的ds RNA纳米颗粒的RNAi效率最高,尤其是在第5天的Boul基因表达水平仅为对照组的0.22倍。而吸收法制备的ds Boul纳米颗粒处理15,20,25天后的基因表达水平与嵌入法制备的无显著差异。在此之后,我们分别使用嵌入法和吸收法,在p H6.5条件下使用了不同质量比(1:1,1:2,1:3,1:4)的壳聚糖:ds RNA组合进行纳米颗粒制备用于RNAi喂食处理。嵌入法制备条件下,质量比为1:4的壳聚糖:ds RNA组合制备纳米颗粒处理25天后基因表达水平显著低于处理组(0.6倍),而吸收法制备条件下,不同壳聚糖:ds RNA组合制备的纳米颗粒处理后皆与对照组无显著性差异。在最适p H 6.5条件下,我们进一步比较了物质配比(Chitosan:ds RNA)为1:1,1:2,1:3,1:4条件下的效果,发现在两种包装技术条件下,1:4物质配比的效果皆优于其它配比条件,且嵌入法效果优于吸收法。两种包装技术方法对chitosan纳米颗粒尺寸的影响研究结果表明:嵌入法产生的纳米颗粒尺寸约为80nm,优于吸收法(约为110nm)。因此在p H6.5和1:4物质配比条件下嵌入法被进一步用于后面一系列生物测定并验证SIT相关基因的功能。与对照组(Chitosan/ds Egfp)和无纳米材料包装的ds Boul相比,处理组导致卵孵化减少77%以上,而产卵量差异不显著。在处理14天后进行雄性橘小实蝇精囊中精子总数的定量,发现进行Chitosan/ds Boul处理的雄性橘小实蝇的精子平均数目显著减少;而精子活力测定则显示处理组的活精子百分比仅为约20%,显著低于对照水平。这些结果表明纳米材料处理显著提高了ds RNA的稳定性和RNAi效率。3.纳米材料包装的ds Boul对昆虫细胞的影响最后,我们检测了嵌入法制备的ds Boul纳米颗粒材料(Chitosan:ds RNA=1:4)对sf9细胞系的影响。通过流式细胞分析技术发现Chitosan/ds Boul处理导致细胞凋亡,且细胞周期停滞在G2期。此外,通过多种细胞死亡率分析和透射电子显微镜(TEM)技术证明Chitosan/ds Boul可诱导Sf9细胞畸形。这些结果表明ds Boul可显著影响sf9细胞系,使细胞停滞于G2期。