论文部分内容阅读
目的:丙戊酸(Valproic acid,VPA)为广谱抗癫痫药物,可单药或联合用药治疗多种类型的癫痫。肝毒性是VPA的严重不良反应之一,高氨血症和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)被认为是肝毒性的主要临床表现。因此,探究VPA肝毒性的生物标志物(Biomarker),对于深入研究VPA致毒机制具有重要意义。脂质在细胞功能中发挥着重要的作用,探究与疾病进展相关脂质表达谱的改变,将为阐明化学异物诱导的毒性反应及其致病机制提供证据。目前,脂质组学(Lipidomics)技术已成为筛选体内生物标志物的主要手段之一,为疾病的早期诊断及治疗提供依据,从而提高治疗的有效性。本课题将从VPA肝毒性癫痫患儿血清及肝细胞的脂质表达谱中,筛选VPA差异性成分。利用分子生物学技术探究VPA导致肝脂质代谢紊乱的相关机制。同时,在癫痫患儿中建立全面考察遗传因素及临床因素的VPA群体药动学模型,为制定临床用药方案,指导个体化用药提供依据。方法:1.基于液相色谱-四极杆飞行时间质谱(LC-Q-TOF/MS)的非靶向脂质组学方法,对VPA肝毒性癫痫患儿血清的脂质进行鉴定,并利用多元统计分析方法(PLS-DA)对鉴定得到的脂质成分进行统计分析,在各组之间获得差异表达的脂质组分。并将差异成分与肝功指标(ALT)进行相关性分析及受试者工作特征曲线(ROC)分析。2.利用MTT法及肝酶水平检测不同浓度VPA的肝毒性。基于LC-Q-TOF/MS的非靶向脂质组学方法,对VPA致肝毒性肝细胞的脂质进行鉴定,并利用多元统计分析方法(PLS-DA)对鉴定得到的脂质成分进行统计分析,获得各组间的差异表达脂质成分。利用脂质组学方法,分析在高脂状态下,VPA对肝细胞内脂质成分的影响。3.油红O染色及试剂盒检测细胞内脂质水平;利用Real-time PCR方法检测VPA对肝细胞内各脂质代谢/转运相关基因的影响。4.检测不同浓度VPA对脂代谢相关蛋白表达的影响;利用siRNA干扰CD36和DGAT2的表达,检测CD36、DGAT2 mRNA和蛋白的表达以及VPA细胞内的脂质水平。5.利用PPARγ选择性抑制剂(GW9662)考察PPARγ在VPA脂质累积中的作用,检测CD36、DGAT2的表达;利用PPARγ选择性激动剂(罗格列酮)考察PPARγ对CD36、DGAT2的作用。6.利用AMPK选择性抑制剂(Compound C)考察AMPK对PPARγ及下游蛋白的影响;利用ERK通路抑制剂(U0126)考察ERK对AMPK、PPARγ及下游蛋白的影响。7.利用Western blot法检测不同浓度VPA对胰岛素通路相关蛋白表达的影响;利用PI3K/Akt通路抑制剂(LY294002)考察Akt通路对PPARγ及下游蛋白的影响。8.利用Western blot法检测肝细胞高脂状态下,VPA对PPARγ及相关蛋白的影响。9.利用NONMEM法建立VPA在癫痫儿童中的PPK模型,定量考察生理因素、临床因素和遗传因素对VPA清除率(CL/F)的影响,并对模型进行稳定性和准确性评价,制定临床用药方案,指导个体化用药。结果:1、基于脂质组学技术筛选VPA肝毒性生物标志物利用脂质组学技术在正负离子模式下分析肝毒性患儿血清脂质成分,共鉴定出176个脂类。经差异脂质成分筛选,最后筛选出20个具有显著差异的脂质成分,包括LPC、SM、Cer、TAG。与肝功正常组患儿(NLF)相比,肝功异常组患儿(ALF)血清中LPCs、SMs和Cers水平显著降低,而TAGs水平则显著升高。与NLF组相比较共有8种长链TAGs在ALF组中显著上调(Fold change>1.5),且与肝毒性程度(ALT水平)呈强正相关。Pearson相关分析及ROC曲线均提示筛选出的差异脂质成分具有较好的预测效能。MTT法及肝酶(ALT、AST)检测提示VPA具有肝细胞毒性。利用脂质组学技术在肝细胞中共鉴定出191个脂类成分。长链TAGs在VPA组细胞中显著升高,且随VPA剂量增加其TAGs水平呈升高趋势。VPA组细胞内TAGs的碳数、双键数与TAGs的升高倍数呈现正相关趋势。利用油酸诱导高脂状态肝细胞,合用VPA后能够导致肝细胞内的TAGs累积加重。说明VPA能够导致长链TAG在肝细胞内的累积。2、VPA导致肝脂代谢紊乱的相关机制研究肝细胞油红O染色及TAG检测确证VPA能够诱导细胞内的脂质累积。Realtime PCR结果显示VPA能够影响各脂质代谢/转运相关基因的表达水平,进而导致细胞内的各脂质水平改变。Western blot结果显示VPA呈剂量依赖性的上调CD36、DGAT2的表达,而相应的siRNA能够显著抑制CD36、DGAT2 mRNA及蛋白的表达,同时抑制了VPA对肝细胞内TAG的累积作用。说明CD36、DGAT2在VPA导致的TAG累积中起重要作用。同时,VPA能够显著上调肝细胞内PPARγ的表达,PPARγ抑制剂(GW9662)能够抑制VPA对CD36和DGAT2的上调作用,同时抑制VPA对肝细胞的脂质累积作用。而PPARγ激动剂(罗格列酮)能够上调CD36和DGAT2的表达。本研究发现VPA能够显著上调p-AMPK和p-ERK的表达。AMPK抑制剂(Compound C)能够显著抑制由VPA诱导的p-AMPK的上调,同时抑制了VPA诱导的PPARγ、CD36及DGAT2的蛋白表达水平。应用ERK抑制剂(U0126)则能够抑制VPA诱导的p-AMPK、PPARγ、CD36、DGAT2的上调。VPA能够显著上调肝细胞内的PI3K、p-Akt的表达,以及IRβ和IRS-1的表达。LY294002能够抑制VPA对PPARγ、CD36、DGAT2的上调作用。在OA诱导的肝细胞高脂状态下,VPA对PPARγ、CD36的上调更为显著,而DGAT2则在高脂状态下表达降低。3、基于遗传因素的癫痫患儿VPA群体药代动力学研究本研究首次系统地评价了遗传多态性对VPA PK的影响,包括CYPs、UGTs、ABC转运体、核受体及其他相关基因。发现LEPR 668A>G突变纯合型(GG型)及突变杂合型(AG型)患者的CL/F较野生纯合型(AA型)患者分别降低22.6%和17.2%。建立的PPK模型能够较好地描述VPA的PK参数,并且定量阐述了体重、日剂量、合用CBZ及LEPR基因多态性对VPA CL/F的影响。结论:1.VPA能够导致肝细胞内长链TAG的累积,加重高脂状态下的肝细胞内的脂肪变性。长链TAG可作为VPA肝毒性的潜在生物标志物。2.VPA可能通过AMPK通路和Akt通路调控PPARγ的表达,进而促进CD36和DGAT2的表达,导致肝细胞内脂质累积。3.在癫痫患儿中建立了基于遗传因素和临床因素的VPA群体药动学模型,指导临床个体化用药,降低不良反应发生。