枸杞多酚提取物抗衰老活性及其作用机制研究

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枸杞的主要成分有多酚、类胡萝卜素、枸杞多糖等,具有抗氧化、抗增殖和抗衰老的功能,被誉为“超级水果”,是现代人的养生首选。过去枸杞相关的研究集中在对枸杞中的功能活性物质进行提取、测定以及鉴别,尤其是针对枸杞多糖的结构鉴定以及活性研究。本文从其他角度出发,以两种枸杞(Lycium ruthenicum Murr.(LRM)和Lycium Barbarum.(LB))的粗提物为研究对象,利用高效液相色谱分析鉴定出主要植物化学物质并确定含量,运用ORAC、PSC对其中的多酚提取物进行体外抗氧化测定,同时以人肝癌细胞HepG2为模型,用CAA法测定枸杞提取物的胞内抗氧化能力。运用亚甲基蓝染色法以人乳腺癌细胞MDA为模型确定枸杞提取物的抗癌细胞增殖活性,并通过测定细胞周期、细胞凋亡及增殖相关基因表达深入探索其抗增殖机制。在此基础上,建立秀丽隐杆线虫衰老模型,通过测定多个寿命指标,包括寿命周期、抗应激反应(紫外照射、热应激、百草枯培养)、脂褐素、行动力、繁殖力等评估枸杞提取物的抗衰老活性,最后利用分子生物手段,以基因表达、酶活水平为依据探讨枸杞提取物抗衰老的潜在机制。本文从食品营养的角度总结枸杞的功效和对人体健康的积极影响,旨在阐明枸杞中天然产物的活性及其药用价值,为抗衰老及相关的膳食指导提供理论依据。主要研究成果如下:(1)LRM和LB中含有大量生物活性物质,二者的多酚都是以游离态为主要存在形式,其中LRM的总多酚、总黄酮含量均高于LB,而LB中VE和类胡萝卜素的含量高于LRM。HPLC结果表明两种枸杞中活性成分差距较大,总的来说,LRM的酚类提取物中花青素是主要成分,LB中抗坏血酸和没食子酸则占主要部分。ORAC、PSC实验结果表明,两种枸杞提取物均具有较高的抗氧化活性,但LRM的抗氧化活性更高,且CAA结果证实其胞内生物利用率也高于LB。(2)LRM和LB表现出了良好的抗乳腺癌细胞增殖的活性,其中LRM的效果更佳,能以较低的浓度对癌细胞造成较高的致死率,二者的EC50分别是4.08±0.09 mg/mL和17.86±1.77 mg/mL。从细胞周期和细胞凋亡测定结果来看,LRM也表现出比空白组更为显著的差异,将更多的细胞阻滞在G1期且呈现更高的早期凋亡率。qPCR实验结果表明,LRM和LB是通过调节p53、p21、CDK、Bax等基因来实现其抗增殖效果的。(3)抗衰老活性研究中,我们发现LRM和LB均能显著延长秀丽隐杆线虫的平均寿命,高剂量组的LRM和LB处理将线虫的平均寿命分别提高了25.19%和51.38%;枸杞提取物还能提高线虫在热激、氧化胁迫以及UV辐照情况下的应激能力,同时枸杞提取物还能改善它们在衰老过程中不断退化的行动力;此外,LRM和LB提取物显著增强了秀丽隐杆线虫中抗氧化酶(包括SOD和CAT)的活性,同时显著降低了脂褐素的水平。综上,枸杞提取物能延缓秀丽隐杆线虫的衰老。(4)进一步的遗传研究表明,线虫体内与寿命相关的关键基因daf-16、sod-2、sod-3、sir-2.1和hsp-16.2的表达水平在摄入枸杞提取物后得到显著上调,而age-1的水平被下调。此外,daf-16(mu86)Ⅰ,sir-2.1(ok434)Ⅳ和hsf-1(sy441)Ⅰ突变体逆转了LRM或LB带来的长寿效应,这证实了这些基因对枸杞介导的寿命延长是必须的。因此,我们得出结论,HSF-1和SIR-2.1以独立于daf-16的形式与IIS信号通路共同调节线虫的寿命。
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