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高血压是脑卒中的首要危险因素。在各种引起脑卒中的常见原因中，由高血压引起的脑卒中，占到脑卒中的一半以上。高血压发展过程中出现的血管重构是引起脑卒中、心肌梗死等高血压并发症的病理基础。血管重构可分为正常向心性重构(eutrophic inward remodeling)和肥厚向心性重构(hypertrophic inward remodeling)两种。血管重构的机制涉及血管壁细胞的增殖、凋亡、迁移、炎症、以及纤维化等。其中，血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖与凋亡的失平衡是高血压血管重构的经典机制之一。
细胞凋亡(apoptosis)作为生长发育过程中的一种精细调控机制，是由基因调控的一种主动死亡形式，是生命的基本现象之一。活性氧(Reactive oxygen species，ROS)包括超氧阴离子(·O2)、过氧化氢(H2O2)、和羟基阴离子(OH-)，可以诱导包括平滑肌细胞凋亡在内的一系列细胞内事件，从而参与许多心血管疾病的发生，这其中就包括高血压、动脉粥样硬化、高脂血症、心肌梗塞、心力衰竭和糖尿病等。目前通常认为有两条经典的凋亡通路，即内源性及外源性通路，两条通路最终汇聚于caspase-3蛋白的激活并导致核降解和特异性的细胞形态学改变。
三七人参皂甙-Rd(panax ginsenoside-Rd)是从三七总皂甙中提取的一种单体有效成分，分子量为1001.2，分子式为C48H82O18·3H2O。本实验室的研究显示三七人参皂甙-Rd是受体操纵性Ca2+通道(receptor-operated calcium channels，ROCC)、Ca2+池操纵性Ca2+通道(store-operated calcium channels，SOCC)特异性的阻断剂，可以抑制ET-1诱导的大鼠脑基底动脉平滑肌细胞田asilarArtery Smooth MuscleCells，BASMCs)的增殖，同时研究也表明三七人参皂甙-Rd可以明显抑制高血压过程中大鼠脑基底动脉和大脑中动脉的重构。基于本实验室已有的工作，本实验将就三七人参皂甙-Rd对H2O2诱导的大鼠BASMCs凋亡的影响进行探讨。将进行的主要工作有：建立H2O2诱导的大鼠BASMCs凋亡模型；观察预孵三七皂甙-Rd后对H2O2诱导的大鼠BASMCs凋亡的影响；初步探讨三七人参皂甙-Rd影响H2O2诱导的大鼠BASMCs凋亡信号转导通路的机制，为三七人参皂甙-Rd预防高血压脑卒中并抑制其发展过程中出现的脑血管重构的现象提供更多的证据。
一.原代培养大鼠BASMCs的鉴定及H2O2诱导大鼠BASMCs凋亡模型的建立
本实验在原代培养的大鼠BASMCs上进行，用细胞免疫荧光法染色对细胞进行鉴定。氧化应激造成的大量ROS的产生及其继发性细胞损伤与VSMCs凋亡过程密切相关。其中H2O2被认为是主要的氧化信号介导者。依据本实验室已有工作确定200μmol·L-1 H2O2处理细胞24h建立稳定凋亡模型。
结果:
1.原代培养的大鼠BASMCs相差显微镜下观察，细胞呈梭形或长梭形，围绕于组织块周围，呈“峰，谷”状高低起伏排列。平滑肌特异的α-actin抗体细胞免疫荧光法染色，可见胞质中细丝状红色阳性反应物，纯度＞95％，可用于后续实验。
2.200μtmol·L-1H2O2处理细胞24h，细胞计数试剂盒-8(cell counting kits-8，CCK-8)检测细胞存活率为75.4士5.0％，流式细胞AnnexinV/PI双染法测得细胞早期凋亡率20.9士3.8％(n=6，*p＜0.05，vs.control group)，Hoechst33258核染色可见凋亡小体，说明外源性给予H2O2处理大鼠BASMCs24h，可诱导细胞凋亡。故本实验选择此条件诱导大鼠BASMCs凋亡，建立模型，为后面深入研究三七人参皂甙-Rd对H2O2诱导大鼠BASMCs凋亡的影响奠定基础。
二.三七人参皂甙-Rd对H2O2诱导的大鼠BASMCs凋亡的影响
本实验利用CCK-8测定细胞存活率，流式细胞术AnnexinV/PI双染法检测细胞早期凋亡率，Hoechst33258核染色法分析三七人参皂甙-Rd对H2O2诱导的大鼠BASMCs凋亡的影响。实验分为阴性对照组、溶媒处理组、三七人参皂甙-Rd处理组、H2O2处理组、溶媒预孵H2O2处理组和三七人参皂甙-Rd预孵H2O2处理组，共六组。
结果:
1.CCK-8检测细胞存活率，结果显示1.25～20μmol·L-1三七人参皂甙-Rd预孵30分钟H2O2处理24h，大鼠BASMCs的存活率依次为68.4士3.1％，65.2±1.7％，59.3士2.2％，46.0士3.2％，34.0±1.2％，三七人参皂甙-Rd可以浓度依赖性降低H2O2处理的大鼠BASMCs的存活率，IC50=9.65±0.88μmol·L-1，此结果与三七人参皂甙-Rd抑制ET-1诱导的大鼠BASMCs的IC50值(10.88+2.06μmol·L-1)较吻合，故接下来的实验三七人参皂甙-Rd剂量均选用10μmol·L-1。
2.用CCK-8检测三七人参皂甙-Rd对H2O2诱导的大鼠BASMCs存活率的影响。结果发现，细胞经H2O2处理后存活率为75.4士5.0％，三七人参皂甙-Rd预孵30分钟H2O2处理24h，细胞存活率为46.0士3.2％(n=6，＃P＜0.05 vs.H2O2treated group)，而溶媒预孵30分钟H2O2处理组细胞存活率为73.8±4.2％，与H2O2处理组相比无统计学差异(n=6，P＞0.05 vs.H2O2 treated group)。
3.Hoechst33258核染色法检测显示，与H2O2处理组相比，三七人参皂甙-Rd预孵30分钟，H2O2诱导的大鼠BASMCs中出现凋亡的细胞数明显增多，形态学改变明显加重；而溶媒预孵30分钟H2O2处理组凋亡形态学改变无明显差异。
4.流式细胞术AnnexinV/PI双染法定量检测凋亡率显示，H2O2诱导的大鼠BASMCs早期凋亡率为20.9+3.8％(n=6，*p＜0.05，vs.control group)，三七人参皂甙-Rd预孵30分钟，H2O2诱导的大鼠BASMCs早期凋亡率为31.5士3.6％(n=6，＃p＜0.05，vs.H2O2 treatedgroup)，而溶媒预孵30分钟，H2O2诱导的细胞早期凋亡率为21.1±4.0％，与H2O2组无统计学差异(n=6，P＞0.05vs.H2O2 treated group)。
三.三七人参皂甙-Rd对H2O2诱导的大鼠BASMCs凋亡的信号转导通路的影响本实验利用western blot和confocal image等方法检测三七人参皂甙-Rd对H2O2诱导的大鼠BASMCs凋亡过程中caspase-3，caspase-9，caspase-8，cytochrome C，Bcl-2，Bax，线粒体膜电位等凋亡相关蛋白及因子的影响。实验分为阴性对照组、溶媒处理组、三七人参皂甙-Rd处理组、H2O2处理组、溶媒预孵H2O2处理组和三七人参皂甙-Rd预孵H2O2处理组，共六组。
结果:
1、三七人参皂甙-Rd对H2O2诱导的大鼠BASMCs凋亡过程中caspase-3蛋白的影响
2、三七人参皂甙-Rd对H2O2诱导的大鼠BASMCs凋亡过程中caspase-8蛋白的影响
3、三七人参皂甙Rd对H2O2诱导的大鼠BASMCs凋亡过程中caspase-9蛋白的影响
4、三七人参皂甙-Rd对H2O2诱导的大鼠BASMCs凋亡过程中线粒体膜电位(△ψm)的影响
5、三七人参皂甙-Rd对H2O2诱导的大鼠BASMCs凋亡过程中cytochrome C蛋白的影响
6、三七人参皂甙-Rd对H2O2诱导的大鼠BASMCs凋亡过程中Bcl-2蛋白和Bax蛋白的影响
结论
1.三七人参皂甙-Rd促进H2O2诱导的大鼠BASMCs凋亡。
2.三七人参皂甙-Rd通过影响细胞凋亡的线粒体途径促进H2O2诱导的大鼠
BASMCs的凋亡，而非受体通路。
3.三七人参皂甙-Rd通过作用于线粒体凋亡途径的重要调节因子Bel-2家族蛋白来影响细胞凋亡的线粒体途径，并最终促进H2O2诱导的大鼠BASMCs凋亡。
统计方法
对本实验数据采用SPSS for windows11.0统计软件包进行方差分析等，不同实验组内差异的显著性，如各组间方差齐采用方差分析S-N-K法或LSD法，如方差不齐采用秩和检验的K-W法，数据以均数士标准差表示，P＜0.05时差异有显著性意义。