研究背景与目的苯暴露可导致机体产生造血毒性,导致造血系统疾病的发生,其毒性机制主要是抑制骨髓造血干细胞的增殖与分化功能。miRNA是一类非编码小分子RNA,参与多种生理和病理过程的调控,包括造血干细胞的自我更新、分化和造血微环境间的调控。最近的研究发现特定的miRNA与外源性有害物质暴露产生的毒性作用之间具有相关性,但是miRNA在苯暴露导致的骨髓造血细胞中的调控作用并不清楚。本研究通过构建苯中毒小鼠模型,在骨髓Lin细胞水平对苯中毒导致的miRNA差异表达谱进行分析,并验证差异表达的造血相关miRNA在骨髓造血祖细胞(Lin-c-Kit+)水平的表达。通过苯暴露导致的骨髓造血细胞miRNA差异表达谱结合苯暴露后小鼠骨髓造血细胞的差异蛋白表达谱对造血相关miRNA进行miRNA-mRNA共表达调控网络分析,筛选出miR-34a-5p在其中发挥主要调控作用;构建miR-34a-5p过表达和表达抑制的K562细胞模型,在此基础上研究miR-34a-5p在1,4-BQ对K562细胞毒性中发挥的生物学功能;在K562细胞中识别并验证miR-34a-5p的靶基因,研究miR-34a-5p的靶基因在1,4-BQ对K562细胞毒性中发挥的调控作用;研究miR-34a-5p在病例组和对照组人群中的表达水平,为苯中毒机制及生物标志提供新的科学线索和依据。第一章苯中毒小鼠骨髓造血细胞的miRNA表达谱以雄性C57BL/6小鼠为实验对象,采用皮下注射的方式进行染毒,苯染毒组浓度为150mg/(kg-b.w.),每周染毒5天,连续染毒4周,对照组小鼠皮下注射同等剂量的食用调和油。染毒结束后对小鼠的一般毒性和造血毒性进行评价,其中一般毒性包括体重和脏器系数,造血毒性包括血常规、造血干细胞比例和骨髓细胞内ROS水平。结果显示苯染毒可导致小鼠体重和胸腺体比显著降低(p<0.05)。外周血检测结果显示苯染毒组小鼠外周血白细胞、红细胞、淋巴细胞明显低于对照组(p<0.05)。流式细胞仪检测骨髓中造血细胞比例的结果表明苯暴露可导致骨髓Lin-c-Kit+细胞和造血干细胞(Lin-c-Kit+Sca-1+)的比例明显低于对照组(p＜0.05)。苯染毒组小鼠骨髓中造血干细胞的ROS水平明显高于对照组,具有统计学差异(p＜0.05)。在上述苯中毒小鼠模型基础上,通过流式细胞仪分选出骨髓Lin-细胞,提取RNA后进行Illumina测序筛选出与苯暴露相关的miRNA差异表达谱。与阴性对照组小鼠相比,苯中毒组小鼠骨髓Lin-细胞中有45个miRNA表达下调,5个miRNA表达上调。第二章苯中毒造血相关差异表达miRNA的筛选及信号通路富集分析应用qRT-PCR在骨髓Lin-细胞水平对8个造血相关miRNA(mmu-miR-34a-5p、mmu-miR-129b-5p、mmu-miR-451a、mmu-miR-144-5p、mmu-miR-342-3p、mmu-miR-196b-5p、mmu-miR-100-5p 和 mmu-miR-181a-5p)的表达水平进行检测并验证。结果显示,qRT-PCR与Illumina测序的结果一致,即苯暴露可导致骨髓 Lin-细胞中 mmu-miR-34a-5p、mmu-miR-129b-5p、mmu-miR-451a 和mmu-miR-144-5p 的表达上调,mmu-miR-342-3p、mmu-miR-196b-5p、mmu-miR-100-5p 和 mmu-miR-181a-5p 的表达下调。进一步在骨髓 Lin-c-Kit+细胞水平对差异表达的造血相关miRNA的表达进行检测。结果显示,苯暴露可导致mmu-miR-34a-5p、mmu-miR-342-3p、mmu-miR-196b-5p、mmu-miR-100-5p 和mmu-miR-181a-5p的表达在骨髓Lin-c-Kit+细胞水平发生改变,表达趋势与骨髓Lin-细胞一致。通过比对上述8个造血相关miRNA在人和小鼠中的序列,发现miR-34a-5p、miR-451a、miR-100-5p、miR-181a-5p、miR-196b-5p 和 miR-342-3p 在人和小鼠中具有同源性。通过靶基因预测软件结合苯暴露后小鼠骨髓造血细胞的差异蛋白表达谱的结果对造血相关miRNA的靶基因进行分析,利用DAVID在线分析数据库对靶基因参与的KEGG信号通路分析,结果显示这些靶基因主要参与的信号通路有钙信号转导通路、促性腺激素释放激素信号通路、卵母细胞减数分裂、长时程增强、细胞骨架调控、ErbB信号传导途径、MAPK信号通路、Wnt信号通路和细胞周期。在此基础上对差异表达的造血相关miRNA构建miRNA-mRNA的共表达调控网络,结果提示表达上调的miR-34a-5p可能通过靶向调控多种靶基因参与上述信号通路在苯诱导的造血毒性中发挥主要调控作用,其次是表达下调的 miR-342-3p 和 miR-196b-5p。第三章miR-34a-5p在1,4-BQ致K562细胞毒性中的生物学功能构建苯的代谢终产物1,4-BQ暴露的K562细胞模型,采用qRT-PCR方法检测1,4-BQ染毒K562细胞后miR-34a-5p的表达改变。结果表明,miR-34a-5p的表达随着1,4-BQ染毒浓度的增加及染毒时间的延长逐渐增加,呈现一定的剂量效应关系和时间效应关系。因此后续实验选择在细胞模型与动物模型一致的miR-34a-5p。同时在该细胞模型上研究1,4-BQ对K562细胞的毒性作用,包括细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、细胞分化和ROS。细胞增殖的结果表明随着1,4-BQ染毒浓度和染毒时间的增加,K562细胞的增殖率逐渐降低。细胞周期的结果显示,G0/G1期和G2期细胞比例随着染毒浓度的增加而降低,S期细胞比例随着染毒浓度的增加而增加。细胞凋亡的结果显示1,4-BQ可显著增加K562细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率,呈现一定的剂量效应关系和时间效应关系。流式细胞仪检测1,4-BQ染毒K562细胞对其向巨核细胞分化的影响,结果显示较高浓度1,4-BQ(20μM和40 μM)可显著增加CD41a的表达,促进K562细胞向巨核细胞分化。1,4-BQ染毒K562细胞2h可促使细胞内ROS显著增加。通过qRT-PCR确定miR-34a-5p mimic和inhibitor转染K562细胞的最佳转染条件。qRT-PCR的结果表明K562细胞转染30 nM mimic和200 nM inhibitor 24 h可显著增加和降低miR-34a-5p的表达(p<0.05),因此后续研究选择该转染浓度模拟miR-34a-5p过表达和表达抑制在1,4-BQ致K562细胞毒性中的生物学作用。结果表明,抑制K562细胞中miR-34a-5p的表达可抑制1,4-BQ对K562细胞的增殖毒性作用,如K562细胞转染miR-34a-5p inhibitor后,20 μM 1,4-BQ染毒组再染毒24h,K562细胞增殖率高于阴性转染组(p<0.05)。细胞周期的结果表明,与阴性转染组相比,K562细胞转染miR-34a-5p mimic后用20 μM 1,4-BQ染毒24 h可导致K562细胞S期细胞比例增加(p<0.05)。细胞分化的结果表明,与阴性转染组相比,在K562细胞中过表达miR-34a-5p可促进20 μM 1,4-BQ染毒过程中向巨核细胞分化(p＜0.05)。细胞凋亡和ROS的结果表明,miR-34a-5p对1,4-BQ致K562细胞凋亡和ROS的毒性作用没有影响。第四章miR-34a-5p在1,4-BQ致K562细胞毒性中的调控机制通过靶基因预测软件结合小鼠苯暴露后骨髓造血细胞的差异蛋白表达谱的结果及miR-34a-5p可参与调控K562细胞的细胞周期的结果,初步筛选出miR-34a-5p的候选靶基因STAG1、STAG2和PCNA。qRT-PCR结果显示miR-34a-5p mimic 和 inhibitor 转染至 K562 细胞后,候选靶基因 STAG1、STAG2和PCNA在mRNA水平未发生明显改变。Western blot检测结果表明在K562细胞中高表达miR-34a-5p可抑制STAG1和STAG2的蛋白表达,抑制miR-34a-5p的表达可促进STAG1和STAG2的蛋白表达,且差异具有统计学差异(p<0.05),改变K562细胞中miR-34a-5p的表达对PCNA的蛋白表达没有影响。双荧光素酶报告基因实验表明过表达miR-34a-5p可导致含有野生型STAG1 3’UTR和STAG2 3’UTR的荧光素酶活性下降(p＜0.05),说明miR-34a-5p可通过与STAG1和STAG2的3’UTR区结合直接靶向调节STAG1和STAG2。为了进一步研究miR-34a-5p在miR-34a-5p在1,4-BQ致K562细胞毒性中的调控机制,Western blot检测了 miR-34a-5p的靶基因在1,4-BQ染毒K562细胞过程中的表达改变。结果表明与阴性转染组相比,K562细胞转染miR-34a-5p mimic 24 h可显著降低20 μM 1,4-BQ染毒24 h后STAG1和STAG2的蛋白表达水平,分别是阴性转染组的0.41和0.79,而转染inhibitor后可显著增加20 μM 1,4-BQ染毒24 h后STAG1和STAG2的蛋白表达水平,分别是阴性转染组的1.76和3.18倍,且与阴性转染组对比具有统计学差异(p＜0.05)。第五章miR-34a-5p对职业苯暴露人群血液毒性的影响收集苯暴露人群外周血样本,根据血常规检查及复查的白细胞计数将苯作业人员分为对照组(WBC>4.5×109/L)和病例组(WBC<4.5×109/L),按年龄和性别进行1:1配对,每组各35例,研究暴露于同样苯环境的对照组和病例组人群外周血中miR-34a-5p的表达是否存在差异。卡方分析的结果显示本研究纳入的对照组和病例组人群的年龄、性别、吸烟和饮酒都没有统计学差异(p>0.05)。qRT-PCR结果表明病例组人群外周血中miR-34a-5p的表达水平是对照组人群的1.91倍,且具有统计学差异(p＜0.05)。因此miR-34a-5p的表达上调可能与苯暴露导致苯中毒之间具有一定的相关性。总结本研究成功构建苯中毒小鼠模型,结果表明苯对造血系统的毒性作用主要是抑制骨髓造血干细胞的增殖与分化功能。通过Illunina测序发现苯暴露可导致骨髓Lin-细胞的microRNA表达谱发生改变。qRT-PCR方法验证了 Illumina测序结果的准确性,并且验证了苯暴露可在骨髓Lin-c-Kit+细胞水平导致造血相关miRNA的表达发生改变。通过苯暴露骨髓Lin-c-Kit+细胞中异常表达的miRNA与差异蛋白表达谱构建miRNA-mRNA共表达调控网络,结果发现miR-34a-5p可能通过钙信号转导通路、卵母细胞减数分裂、ErbB信号传导途径、Wnt信号通路、MAPK信号通路和细胞周期等信号通路参与苯诱导的造血毒性。通过构建miR-34a-5p过表达和表达抑制的K562细胞模型,结果表明miR-34a-5p可与细胞周期信号通路相关基因STAG1和STAG2的3’UTR区结合,在蛋白水平调控STAG1和STAG2的表达,从而影响K562细胞的细胞周期分布。进一步通过1,4-BQ染毒miR-34a-5p过表达和表达抑制的K562细胞,结果表明抑制K562细胞中miR-34a-5p的表达可抑制1,4-BQ对K562细胞的增殖毒性作用。miR-34a-5p可通过调控STAG1和STAG2的蛋白表达影响1,4-BQ染毒过程中K562细胞的细胞周期分布,从而影响苯及其代谢终产物诱导的造血毒性作用。与对照组人群相比,miR-34a-5p在病例组人群外周血中呈表达上调趋势,说明miR-34a-5p的表达增加可能促进苯暴露人群发生苯中毒。综上,本课题首次在骨髓Lin-c-Kit+细胞水平研究miRNA在苯诱导造血毒性中的作用,并首次发现miR-34a-5p可通过靶向调控STAG1和STAG2的蛋白表达影响1,4-BQ致K562细胞毒性的作用,同时发现miR-34a-5p在病例组人群外周血中呈表达上调趋势,有较好的创新性和实际意义。因此,本课题研究结果为miRNA在苯及其代谢产物的造血毒性中的作用机制研究提供了重要的科学依据。