研究背景神经胶质细胞瘤是起源于神经上皮组织的原发性中枢神经系统肿瘤,约占颅内肿瘤的40%,是中枢神经系统常见肿瘤之一。WHO根据组织学证据和预后评分系统可分将胶质瘤细胞为Ⅰ-Ⅳ级。胶质母细胞瘤根据分级属于Ⅳ级胶质瘤,属于恶性程度最高的神经胶质瘤,表现为失控生长,并向周围组织侵袭生长的特性,传统的手术切除结合术后的放疗及化学治疗的效果不理想,复发率高,预后差,是严重影响人类健康的疾病。近20年来,随着对胶质母细胞瘤相关生物学特性以及相关分子机制的研究不断深入,揭示了神经胶质细胞发生,发展的相关分子机制有了进一步的了解,也发现了治疗胶质母细胞瘤相关的新的治疗靶点,以及多种新型药物和新的治疗方法及途径。但是,这些新的措施在分子水平调控的机制尚未完全清楚。所以进一步探索胶质母细胞瘤的发病机制及发掘更有效的治疗措施,仍然是目前神经科学领域的研究热点。随着植物中有效成分提取、纯化技术的不断进步,植物提取药物在神经瘤的治疗中的作用越来越受到重视。Fucoxanthin(岩藻黄素),是一种从海藻及裙带菜中提取的类胡萝卜素成分,其分子式中有生物活性的官能团包含累积二烯烃、共轭羰基,乙酰基,从而使得岩藻黄素具有了抗氧化活性,并可诱导肿瘤细胞凋亡。现已有相关研究证明岩藻黄素可减少黑色素瘤细胞和骨肉瘤细胞的浸润和转移能力。但目前尚未见有岩藻黄素对胶质母细胞瘤影响作用的相关报道。目前已有大量的研究资料证实,PI3K/Akt/mTOR和MAPK信号途径在调控肿瘤细胞发生发展中发挥着重要作用。在包括胶质母细胞瘤在内的多种恶性肿瘤中,这两个信号途径都呈现过度磷酸化的激活状态,从而激活下游基因,引起肿瘤细胞恶性增殖、抗凋亡,并呈现侵袭性生长状态等特性。因此,本课题拟通过体外和体内两部分实验对Fucoxanthin抑制胶质母细胞瘤增殖、迁徙、侵袭及凋亡作用研究,分析PI3K/Akt/mTOR和MAPK信号途径在调控肿瘤细胞发生发展中的作用机制。研究目的1.研究Fucoxanthin对胶质母细胞瘤和神经元细胞的抑制增殖；2.研究Fucoxanthin对胶质母细胞瘤诱导凋亡作用；3.研究Fucoxanthin在抑制增殖和诱导凋亡中涉及的分子机制；4.研究Fucoxanthin对胶质母细胞瘤迁徙和侵袭的抑制作用；5.研究Fucoxanthin在抑制胶质母细胞瘤迁徙、侵袭过程中所涉及的分子机制；6.研究Fucoxanthin在体内抑制胶质母细胞瘤生长并诱导细胞凋亡。研究方法1. Fucoxanthin对U87细胞和神经元细胞增殖抑制作用设置不同浓度的Fucoxanthin (Medium, Medium+DMSO、6.25μM、12.5μM、 25μM、50μM、75μM、100μM)分别处理胶质母细胞瘤(12、24、48小时),并采用四甲基偶氦唑盐(MTT)比色法检测Fucoxanthin对细胞增殖的影响。取小鼠E18胎鼠大脑上皮神经元细胞,设置不同浓度的Fucoxanthin(0μM、 25μM、50μM)处理神经元细胞24小时,使用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测Fucoxanthin对神经元细胞增殖的影响2. Fucoxanthin诱导U87凋亡设置不同浓度的Fucoxanthin (0μM、25μM、50μM)处理细胞24小时,采用Hoechst 33342染色各组细胞,于荧光显微镜下拍摄照片。设置不同浓度的Fucoxanthin (0μM、25μM、50μM)处理细胞24小时,采用DIOC6(3)染色各组细胞,流式细胞仪检测线粒体膜电位变化。设置不同浓度的Fucoxanthin (0μM、25μM、50μM)处理细胞24小时,采用Annexin V-FITC/S YTOX Green双染各组细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡。设置不同浓度的Fucoxanthin (0μM、50μM)处理细胞24小时,收集并处理细胞后,使用透射电子显微镜观察细胞亚显微结构。3.检测Fucoxanthin在诱导凋亡过程中凋亡相关蛋白的表达设置不同浓度的Fucoxanthin (0μM、25μM、50μM)处理细胞24小时后Western blotting检测H2AX、Bcl-2、PARP、BAX、caspase-9、caspase-3的蛋白水平变化。4. PI3K/Akt/mTOR及下游相关蛋白在Fucoxanthin诱导凋亡过程中的作用机制设置不同浓度的Fucoxanthin (0μM、25μM、50μM)处理细胞24小时后Western blotting检测Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的蛋白水平变化。进一步验证Fucoxanthin通过PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导细胞凋亡,设置Fucoxanthin (0μM、50μM)组并加入PI3K抑制剂LY294002处理细胞24小时后Western blotting检测Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、Bcl-2、BAX、 Cleaved-capase-9的蛋白水平变化。5.细胞划痕实验检测细胞迁移将U87细胞接种于6孔板中,24小时后使用200微升枪头整齐划出划痕,更换无血清培养基后加入不同浓度Fucoxanthin (0μM、25μM、50μM)处理细胞18小时后,镜下观察瘢痕修复情况并拍照,瘢痕修复率=(初始痕宽一处理后痕宽)/初始痕宽。6. Transwell检测细胞迁徙使用含1%FBS培养基重悬U87细胞接种于上小室,20%FBS培养基置于下室,不同浓度的Fucoxanthin (0μM、25μM、50μM)处理细胞24小时后,0.1%结晶紫染色后镜下观察并拍照,33%醋酸溶解结晶紫后测量各组570 nmOD值。7. Transwell检测细胞侵袭将U87细胞接种于预先铺设基质胶的上小室内,使用含1%FBS培养基重悬U87细胞接种于上小室,20%FBS培养基置于下室,不同浓度Fucoxanthin(OμM、 25μM、50μM)处理细胞24小时后,0.1%结晶紫染色后镜下观察并拍照,33%醋酸溶解结晶紫后测量各组570 nmOD值。8.在Fucoxanthin的作用下影响胶质母细胞侵袭迁移相关蛋白的变化将不同浓度的Fucoxanthin (0μM、25μM、50μM)处理U87细胞24小时后,Western blotting检测MMP-9、MMP-2、uPA的表达水平的变化。9.检测MMPs上游MAPK途径相关蛋白的表达水平的影响将不同浓度的Fucoxanthin(0μM、25μM、50μM)处理U87细胞24小时后,Western blotting检测p38、p-p38、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白表达水平的变化。Fucoxanthin (0μM、50μM)并加入p38抑制剂SB203580,处理细胞24小时后Western blotting检测p38、p-p38、MMP-9、MMP-2的蛋白水平变化。10.裸鼠皮下成瘤实验检测Fucoxanthin抑制肿瘤生长并诱导细胞凋亡U87细胞(5×106)被注射在5周裸鼠腋下,注射后次日将Fucoxanthin(0、1 g/kg)溶解于豆油寄予口服给药,每隔7天测量一次肿瘤体积,给药28天后将瘤组织取出并测量肿瘤重量。瘤组织切片H&E、TUNEL染色后镜下观察并拍照。提取瘤组织蛋白,Western blotting检测Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、Bcl-2、 BAX、Cleaved-capase-9、p38、p-p38、MMP-9、MMP-2蛋白表达水平变化。11.统计学分析所有数据用均数±标准差(x±s)表示,使用Sigmastat3.5统计学软件,多组间比较采用单因素方差分析,Turkey检验,P<0.05认为有显著差异。研究结果1. Fucoxanthin诱导U87细胞增殖抑制并对神经元细胞生存率无影响四甲基偶氮唑盐(MYT)比色法检测不同浓度梯度和时间的Fucoxanthin对胶质母细胞瘤U87细胞增殖影响。相对于空白对照组和对照组,发现50、75和100 μM组在12、24、48小时,细胞增殖能力减少具有统计学意义(P<0.05)；251.tM组在48小时,细胞增殖能力减少具有统计学意义(P<0.05)。证明Fucoxanthin对U87细胞的增殖抑制能力。四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测不同浓度梯度Fucoxanthin (25、50μM)对神经元细胞的增殖影响,相对于空白对照组,25、50gM组在作用24小时后,神经元细胞生存率无统计学意义。.2. Fucoxanthin诱导U87细胞凋亡不同浓度的Fucoxanthin (0μM、25μM、50μM)处理细胞24小时,使用hoechst 33342染色后显微镜下观察发现,不同剂量Fucoxanthin处理U87细胞24小时,核皱缩、身染率增加,存在统计学差异(F=57.506,P<0.001),多重比较结果提示,各组相对于对照组核皱缩、深染率增加了(P<0.05)。使用DIOC6(3)染色,检测线粒体膜电位的去极化,可以反应线粒体的正常功能,线粒体功能降低是细胞凋亡过程中不可缺少的部分,不同剂量Fucoxanthin (0μM、25μM、50州)处理细胞后线粒体膜电位降低,具有统计学差异(F=431.583,P<0.001),多重比较结果提示,各组相对于对照组线粒体膜电位均降低(P<0.001)。不同浓度Fucoxanthin (0μM、25μM、50μM)处理U87细胞24小时后Annexin V-FITC/SYTOX Green双染各组细胞,上流式细胞仪统计发生凋亡的细胞比例,统计结果提示,不同剂量Fucoxanthin处理后凋亡率存在统计学差异(F=259.15,P<0.001),多重比较结果提示,各组相对于对照组凋亡率均增加(P<0.005)。不同剂量Fucoxanthin (0μL、50μM)处理细胞24小时,电子显微镜观察细胞亚结构,发现50μM组发现大量核边集、碎裂细胞核。这一结果同Fucoxanthin抑制细胞增殖结果一致。3. Fucoxanthin诱导细胞凋亡相关蛋白的表达为了进一步验证Fucoxanthin诱导凋亡的潜在机制,通过Western blot实验检测细胞凋亡的线粒体途径相关蛋白。通常认为Bcl-2/Bax的比值作为凋亡促进或抑制的开关,发现抗凋亡蛋白Bc1-2表达的下降和促凋亡蛋白Bax表达的升高,提示Fucoxanthin诱导凋亡的发生。Bax的高表达凋亡信号传导给下游的caspase系统,其下游蛋白活化的cleved-PARP、caspase-9、caspase-3表达均明显升高。H2AX作为染色体受损后重要标志物,药物处理组也出现明显升高。4. Fucoxanthin通过抑制PI3K/Akt/mTOR途径诱导细胞凋亡不同浓度处理Fucoxanthin (0μM、25μM、50μM)作用于U87细胞24后,Western Blot实验检测Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR,发现p-Akt、p-mTOR的表达随着Fucoxanthin呈现浓度依赖性下调,而Akt、mTOR并未出现明显的变化。进一步验证Fucoxanthin通过PI3K/Akt/mTOR途径诱导细胞凋亡,加入PI3K抑制剂LY294002, Fucoxanthin+LY294002组p-Akt、p-mTOR表达量最低。PI3K/Akt/mTOR下游凋亡相关蛋白,LY294002+Fucoxanthin组Bcl-2表达量明显降低,Bax、cleved-caspase-9表达量明显升高。说明Fucoxanthin通过抑制PI3K/Akt/mTOR途径诱导U87细胞的凋亡。5.Fucoxanthin抑制胶质母细胞瘤U87的迁移和侵袭细胞划痕实验检测Fucoxanthin抑制U87细胞迁移,不同浓度Fucoxanthin处理U87细胞18小时后,瘢痕修复率存在浓度依赖性降低,具有统计学差异(F=145.252,P<0.001),多重比较各组对于对照修复率均降低(P<0.05)。Transwell检测Fucoxanthin抑制U87细胞细胞迁移,不同浓度Fucoxanthin处理U87细胞24小时后,上室U87细胞迁移率出现浓度依赖性降低,具有统计学差异(F=205.683,P<0.001),多重比较各组对于对照组迁移率均降低(P<0.05)。Transwell检测Fucoxanthin抑制U87细胞细胞侵袭,不同浓度Fucoxanthin处理U87细胞24小时后,上室U87细胞侵袭率出现浓度依赖性降低,具有统计学差异(F=60.087,P<0.001),多重比较各组对于对照组迁移率均降低(P<0.05)。说明Fucoxanthin可以抑制胶质母细胞瘤向邻近组织迁移。6. Fucoxanthin抑制迁移和侵袭相关蛋白的表达为了进一步验证Fucoxanthin诱导凋亡的潜在机制,通过Western blot实验测迁移和侵袭相关蛋白uPA、MMP-2、MMP-9的表达。已经发现uPA作为MMP-2. MMP-9的上游调节蛋白,可以调节MMP-2、MMP-9的表达。结果表明uPA、MMP-2、MMP-9存在浓度依赖性降低。7. Fucoxanthin通过抑制MAPK途径诱导细胞及下游蛋白抑制迁移和侵袭不同浓度处理Fucoxanthin (0μM、25μM、50μM)作用于U87细胞24后,Western Blot实验检测p38、p-p38、ERK、p-ERK,发现p-p38随浓度升高表达量降低,而p-ERK却随浓度的升高表达量下降,其他途径激活p-EKR促进肿瘤细迁移和侵袭。为了进一步证明Fucoxanthin可以通过抑制p38信号途径抑制胶质母细胞瘤U87细胞的迁移和侵袭,加入p38抑制剂SB203580,发现Fucoxanthin+SB203580组p-p38表达量最低,p38信号通路下游蛋白MMP-2. MMP-9相对去其他组表达量最低。说明Fucoxanthin通过抑制p38信号途径抑制了胶质母细胞瘤U87细胞的迁移和侵袭。8. Fucoxanthin抑制裸鼠体内U87肿瘤的生长并诱导其凋亡已经证实,Fucoxanthin可以在体外抑制U87细胞的增殖,诱导其发生凋亡。在裸鼠体内实验中,皮下注射U87细胞后给予不同处理的裸鼠,第一周、第二周对照组和药物组肿瘤体积,无明显统计学差异。注射后第三周药物处理组肿瘤体积小于对照组且存在统计学差异,注射后第四周肿瘤体积差异变大,具有存在统计学意义(P<0.01)。28天后取出瘤组织,药物组和对照组肿瘤组织重量存在统计学意义(P<0.05)。相对于对照组,药物组H&E、TUNEL染色提示凋亡的发生。提示Fucoxanthin通过促进U87细胞的凋亡抑制了肿瘤体积的增大。对瘤组织蛋白表达检测,药物组凋亡、迁徙相关蛋白Akt.p-Akt.mTOR、p-mTOR、 Bcl-2、BAX、Cleaved-capase-9、p38、p-p38、MMP-9、MMP-2分析,进一步证明了Fucoxanthin通过抑制PI3K/Akt/mTOR途径诱导细胞凋亡和通过抑制P38途径诱导细胞及下游蛋白抑制迁移和侵袭。