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为了研究仔猪抗菌肽PR-39和PG-1基因的发育表达规律和谷氨酰胺（Gln）对其表达调控及肠道保护作用的影响，本课题运用半定量RT-PCR技术，研究了日龄、断奶及Gln对仔猪抗菌肽PR-39和PG-1 mRNA表达的影响，并探讨了Gln对断奶仔猪肠道保护作用的机制。这对今后抗生素替代产品、环保型饲料添加剂的开发与应用具有重大的指导意义。其主要研究结果如下：1．根据已报道的猪PR-39、PG-1及18S rRNA基因序列，分别设计引物，以21日龄未断奶仔猪的骨髓、胸腺、肠系膜淋巴结及脾脏为研究对象，分别探讨了PCR体系中循环数对其产物IOD值的影响。结果表明，以2μg总RNA进行反转录，再以反转录产物为模板，30μL反应体系中，Mg2+浓度控制在1.5mmol／L，PR-39、PG-1、18S rRNA的退火温度分别为58℃、58℃、52℃，循环数分别选择在31、31和25次时，它们的电泳条带清晰且处在线性扩增范围内。2．随机屠宰1、3、14、23、28日龄未断奶以及21日龄断奶后2 d（23日龄断奶）和21日龄断奶后7 d（28日龄断奶）的健康、体重相近的杜长大仔公猪各4头，分别取股骨骨髓、胸腺、脾脏、肠系膜淋巴结，以18S rRNA为内参，用构建的RT-PCR方法进行半定量分析PR-39和PG-1 mRNA的相对表达量。结果表明：日龄显著影响仔猪骨髓和胸腺中PR-39 mRNA的表达（p＜0.05）。骨髓和胸腺中PR-39 mRNA的相对表达量均表现为刚出生时最低，吮吸初乳2天后，其表达水平较刚出生时显著升高（p＜0.05）。14日龄时较3日龄下降，此后又缓慢上升；日龄对脾脏和肠系膜淋巴结中PR-39 mRNA相对表达量影响不显著（p＞0.05）；PG-1 mRNA的相对表达量在骨髓和脾脏中随日龄的增加显著上升（p＜0.05），但在胸腺和肠系膜淋巴结中各日龄间差异不明显（p＞0.05）；相同日龄不同组织中PR-39和PG-1 mRNA的相对表达量存在显著差异（[＜0.05），从高到低依次为骨髓、胸腺、脾脏和肠系膜淋巴结；断奶显著降低骨髓和胸腺中PR-39 mRNA以及骨髓中PG-1 mRNA的相对表达量（p＜0.05）。以上结果表明，PR-39和PG-1 mRNA在仔猪体内存在明显的组织特异性和年龄依赖性，并且断奶显著降低其表达。3．取仔猪股骨骨髓粒细胞，在基础培养基中添加不同浓度（0，300，450，600μg／mL）的Gln进行诱导培养，10 h后，分析各处理粒细胞中PR-39和PG-1 mRNA的相对表达量和相应上清液的抑菌效果及碱性磷酸酶（ALP）活性、细胞因子IL-6和TNF-α的含量。结果表明：培养基中添加Gln显著促进骨髓粒细胞中PR-39和PG-1基因表达（p＜0.05）。与基础培养基相比，培养基中添加300、450、600μg／mL Gln的粒细胞中PR-39 mRNA相对表达量分别增加61.1％（p＞0.05）、133.3％（p＜0.05）、51.9％（p＞0.05），PG-1 mRNA相对表达量分别增加13.9％（p＞0.05）、32.4％（p＜0.05）、22.2％（p＜0.05）；与之相应，其上清液的抑菌活性单位分别增加154.0％（p＜0.05）、55.1％（p＞0.05）和14.4％（p＞0.05）；ALP活性单位分别提高51.9％（p＜0.05）、42.6％（p＜0.05）、14.0％（p＞0.05）；IL-6的含量分别提高66.9％（p＜0.05）、42.5％（p＞0.05）、33.2％（p＞0.05）；TNF-α的含量在培养基中添加300和600μg／mL Gln时分别增加81.3％（p＜0.05），50.0％（p＜0.05）。以上结果提示，谷氨酰胺显著促使体外骨髓粒细胞中PR-39和PG-1基因的表达。4．选取64头胎次相同、28日龄断奶、体重相近（7.5 kg左右）、健康的三元杂交仔猪（杜×长×大）（公母各半），随机分为2处理，即基础日粮对照组和1％Gln添加试验组，每组32头猪平分4栏进行饲养（公母各半）。于28天，每栏分别取1头体重相近的小公猪进行保定采血，分离淋巴细胞和血清，分别进行淋巴细胞增殖率和血清中细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量的分析。于30天，每栏分别取1头体重相近的小公猪进行屠宰，分别取直肠、盲肠、结肠内容物进行肠道菌群分析；取十二指肠、空肠和回肠制光镜切片，观察小肠绒毛、隐窝的变化；取空肠粘液和粘膜分别进行S-IgA和细胞因子TNF-α和IL-2分析；分别取左腿股骨骨髓和空肠粘膜，以18S rRNA为内参，采用半定量RT-PCR研究日粮中添加Gln对其PR-39和PG-1 mRNA的影响。结果表明：Gln添加能提高仔猪由PHA诱导的外周血淋巴细胞增殖率8.6％（p＜0.05）；血清中IL-1β含量增加28.6％（p＜0.05），但对IL-6和TNF-α含量无显著影响（p＜0.05）。Gln添加显著增加肠道有益菌，减少致病菌。与对照组相比，直肠、盲肠、结肠内容物中乳酸杆菌分别增加2.8％（p＜0.05）、4.1％（p＜0.05）和4.0％（p＜0.05），双歧杆菌分别增加9.4％（p＜0.01）、9.7％（p＜0.01）和9.6％（p＜0.01），大肠杆菌分别降低3.0％（p＜0.05）、2.9％（p＜0.05）和3.3％（p＜0.05）；Gln明显提高断奶仔猪十二指肠、空肠和回肠绒毛高度（p＜0.01），降低隐窝深度（p＞0.05）；Gln显著促使骨髓中PR-39、PG-1以及空肠粘膜中PR-39 mRNA表达（p＜0.05）；与对照组相比，骨髓中PR-39、PG-1和空肠粘膜中PR-39 mRNA分别提高50.5％（p＜0.05）、27.6％（p＜0.05）和24.0％（p＜0.05），肠粘液中S-IgA含量增加30.1％（p＜0.05），空肠粘膜中TNF-α、IL-2分别增加37.3％（p＞0.05）、18.0％（p＞0.05）。以上结果表明，断奶仔猪日粮中添加Gln能显著促使骨髓及空肠粘膜PR-39 mRNA及骨髓PG-1 mRNA表达上调，改善肠道微生态菌群，减缓断奶引起的免疫抑制。这揭示Gln维护断奶仔猪肠粘膜形态的完整性可能与Gln显著促使其抗菌肽PR-39和PG-1 mRNA表达上调和改善肠道微生态菌群密切相关。