花生子叶抗菌蛋白累积和动员的细胞学研究

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以花生(Arrachis hypogaea L.)汕油523种子为材料,在实验室前期研究的基础上,对花生种子在发育、萌发和受黄曲霉侵染过程中抗菌蛋白的累积和动员情况进行研究,旨在阐明抗菌蛋白与菌丝侵入的关系。  通过免疫组化技术,对抗菌蛋白(2S-1、2S-5b和PI蛋白)在花生种子发育过程中组织水平上的累积变化进行观察发现,2S-1、2S-5b和PI蛋白在花生32DAP(day after pegging)时就已出现,并且随着发育天数的增加而逐渐累积。40~48DAP期间,三种抗菌蛋白均出现在子叶外缘,推测这与发育过程中抵御外源微生物入侵有关。  通过免疫组化技术,从组织水平上对抗菌蛋白(2S-1、2S-5b和PI蛋白)在花生种子萌发过程中的动员情况进行观察发现,2S-1、2S-5b和PI蛋白随着萌发天数的增加而逐渐降解。2S-1和2S-5b蛋白在花生萌发2~4d和8~10d时降解明显,PI蛋白在花生萌发0~2d和8~10d时降解明显,说明在花生种子萌发过程中PI蛋白的动员早于2S-1、2S-5b蛋白。  利用激光扫描共聚焦显微镜观察花生子叶抗菌蛋白与黄曲霉菌丝(Aspergillus flavus)侵入的关系发现,黄曲霉菌丝和花生子叶在同一激发光下具有同样颜色的自发荧光,黄曲霉菌丝和花生子叶同时存在,无论淬灭两者中的任何一者的自发荧光,另一者的自发荧光也被淬灭,因此不能利用自发荧光来观察侵染时期抗菌蛋白与黄曲霉菌丝之间的关系。用组织自发荧光淬灭剂分别处理10、30、60min,处理10min时两者的自发荧光完全被淬灭,同时对WGA-594(红色荧光)和FITC-IgG(绿色荧光)的荧光影响不大。选用荧光染料WGA-594和FITC-IgG分别标记黄曲霉菌丝和花生子叶抗菌蛋白(2S-1、2S-5b、PI),根据荧光颜色的不同,观察侵染不同时期,花生子叶抗菌蛋白与黄曲霉菌丝之间的关系。2S-1、2S-5b和PI蛋白都做出响应,在某种程度上表现出时间与空间的累积和动员过程。2S-1蛋白在侵染1~3d期间,蛋白含量增加,侵染4~7d期间,蛋白含量逐渐降低。2S-5b蛋白在侵染1~3d期间,蛋白含量降低,侵染4d时,蛋白含量增加,侵染5~7 d期间,蛋白含量逐渐降低。PI蛋白在侵染1d,蛋白含量降低。侵染2d时,蛋白含量增加,侵染3~7d期间,蛋白含量逐渐下降。2S-5b和PI对侵染菌丝会有一个跟踪式分布,而2S-1则没有。响应时间顺序早晚为2S-1蛋白最早,PI蛋白次之,2S-5b蛋白最晚。同时发现黄曲霉菌丝侵染花生子叶可以分为四个时期,即侵染前期、侵入期、蔓延期、显症期。
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