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本文主要从以下几个部分展开论述: 第一部分:鄱阳湖星子县区日本血吸虫病媒介钉螺生存情况调查和钉螺感染外睾吸虫情况及阴性钉螺的培育 近年来,本实验室经过2000-2014年的长期研究,发现先感染外睾吸虫的湖北钉螺再感染日本血吸虫,会出现日本血吸虫幼虫被杀死的现象。并且感染外睾吸虫后再感染日本血吸虫的间隔时间越长,幼虫的死亡速度越快,但其具体的控制机理尚未完全弄清楚,因此我们致力于了解外睾吸虫幼虫在自然界感染钉螺情况的调查,并探索其深层次的调节机制。在宏观方面,本部分主要是在江西鄱阳湖采集湖北钉螺进行野外调查,并探索在厦门大学生命科学学院实验室建立一组钉螺的人工繁殖系统可行性,在室内模拟野外条件下的钉螺产卵及发育的观察,在实验室建立阴性湖北钉螺人工繁殖系统,培养人工感染日本血吸虫的湖北钉螺和人工感染外睾吸虫的湖北钉螺,为后期分子实验提供基本的实验材料。同时,本部分也对钉螺在鄱阳湖星子县区水域的分布情况和感染状况进行了现场调查。我们选择离岸水平距离、建立不同的采集样方、统计钉螺的数量、存活率和其他吸虫感染状况,探讨其滨水分布规律。 第二部分:湖北钉螺OhTRX的克隆表达及生物信息学分析 为了更深入地探究利用外睾吸虫生物控制日本血吸虫的分子机制,我们实验室在国家自然科学基金的资助以及上海寄生虫研究所同行的协作下,针对阴性钉螺、外睾吸虫阳性钉螺、日本血吸虫阳性钉螺以及两种吸虫双重感染的阳性钉螺进行了转录组测序与差异表达分析,结果发现在感染外睾吸虫后的湖北钉螺体内的硫氧还蛋白(TRX)呈高度表达的状态,远远高于阴性钉螺或者只被日本血吸虫感染的钉螺以及双重感染的钉螺。TRX是一种具有很强的调节氧化还原作用的小分子蛋白,广泛存在于各类生物体之中,是一种十分有效的抗氧化物质,同时兼具有抗凋亡作用,生长因子作用,对蛋白质的修复与还原作用。大部分寄生虫需要在宿主体内大量复制,TRX除了能够去除寄生虫因代谢产生的活性氧簇(ROS)与和其相似的活性氮族分子(RNS),而且在抵抗宿主免疫细胞产生的RNS和ROS的潜在损伤中起着十分关键的作用。本部分研究致力于克隆和表达湖北钉螺硫氧还蛋白(OhTRX)基因,了解该基因在湖北钉螺内的表达和分布。通过把OhTRX基因亚克隆到表达载体pET-28a中,达到构建重组表达质粒并诱导其表达的目的。 第三部分:OhTRX多克隆抗体的制备和免疫组化 本部分参考基因的扩增方法,获得OhTRX的全长cDNA序列,构建重组表达质粒OhTRX-PET-28a,表达纯化获得蛋白后再免疫KM株小白鼠,获得多克隆抗体,通过Western-blot检测重组蛋白的抗原性和免疫原性,通过免疫组化的方法,对该蛋白在湖北钉螺体内的表达部位进行观察和分析。经过本次实验,作者成功地构建了重组表达质粒OhTRX-pET-28a(+),并在大肠杆菌中获得表达;Western-blot的结果表明了重组蛋白具有良好的抗原性和免疫原性;根据免疫荧光观察,显示TRX蛋白在湖北钉螺的各个组织中有表达,尤其是肠道和消化腺,再一次地论证了其与机体的氧化还原作用密切相关,调控寄生虫的抗氧化作用以及可能与某些细胞信号转导有关。