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目的:血管钙化是糖尿病患者并发心血管疾病的主要表现之一,也是糖尿病患者死亡的重要危险因素。糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)作为糖尿病的严重并发症之一,其发生发展和糖尿病血管损伤紧密相关。已有研究表明,糖尿病患者比非糖尿病患者更易发生动脉血管钙化,而DN患者的钙化程度更为严重及普遍。目前对DN血管钙化的研究大多集中在外周动脉及冠状动脉,而对肾动脉血管的改变知之甚少。本研究通过观察糖尿病肾病基础上给予增强血管钙化的因素后,肾动脉钙化程度与肾功能进展的关系,同时观察糖尿病肾病大鼠肾动脉上BMP2及其下游因子Smad1,Runx2和Osterix的基因及蛋白变化情况,探讨糖尿病肾病时肾动脉钙化严重程度与糖尿病肾病进展的关系,及BMP2/Smad1/Runx2/0sterix信号通路激活在糖尿病肾病大鼠肾动脉钙化的作用。方法:将64只SD大鼠随机分为对照组(CON组,18只))、糖尿病肾病组(DN组,22只)、糖尿病肾病合并血管钙化组(DN+VDN组,24只),DN组及DN+VDN组高脂饲料喂养4周后,予以单次腹腔注射1%链脲佐菌素(STZ)溶液35mg/kg诱导糖尿病,CON组注射同等体积的0.1mmol/L柠檬酸盐缓冲液。72小时后测血糖,连续三天血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病成模。2周后,24 h尿蛋白量大于30 mg,尿量>原尿量50%者为DN模型制备成功。DN成模第二天,DN+VDN组以维生素D3(300 000U/kg)肌肉注射,将尼古丁(25 mg/kg)完全溶解于花生油中给DN+VDN组大鼠灌胃,9 h后再灌胃一次,其余两组予等量花生油灌胃及生理盐水肌注。8、12和16周时收集各组大鼠尿液检测24小时尿白蛋白(24-h Upro);心脏采血检测血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、空腹血糖、胱抑素C(CysC)。大鼠肾脏组织病理检查:清洁取肾,石蜡包埋后行HE染色,观察肾小球和肾小管间质的基本病理改变情况。摘取双侧肾动脉用生理盐水冲洗后,Von Kossa染色观察大鼠肾动脉钙盐沉积,并用钙离子试剂盒检测肾动脉组织钙含量。免疫荧光双染检测各组大鼠肾动脉组织BMP2/α-SMA和Runx2/α-SMA蛋白表达变化。免疫组化检测大鼠肾动脉组织BMP2、Smad1、Runx2及Osterix蛋白的表达。实时荧光定量(RT-PCR)检测各组大鼠肾动脉组织BMP2和Runx2的基因表达。结果:1、大鼠一般情况①体重:与CON组比较,模型组体重明显减轻,但DN组及DN+VDN组各时间点体重无明显统计学差异。②血糖:CON组血糖在正常水平范围波动,DN组及DN+VDN组大鼠血糖值显著高于同时间点CON组,且两模型组间血糖无统计学差异。③血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr):与CON组相比,DN组及DN+VDN组大鼠BUN值于实验8周后明显升高,12周后DN组和DN+VDN组血Scr亦显著升高(P<0.05),而DN组与DN+VDN组间BUN、Scr值均无明显统计学差异。④胱抑素C(CysC):实验期间,DN组大鼠血清CysC水平明显高于同时间点CON组,低于DN+VDN组(P<0.05)。⑤24小时尿白蛋白(24-h Upro):8周后DN组及DN+VDN组大鼠24-h Upro较CON组开始上升,随时间的延长进行性加重,并于16周末DN+VDN组大鼠的24-h Upro较同期DN组明显升高(P<0.05)。2、大鼠肾动脉钙化的特征:①Von Kossa染色:CON组大鼠肾动脉组织各时间点均未见明显异常,DN组及DN+VDN组大鼠8周末时即可见血管内膜及中膜弹性纤维间大量黑色颗粒,且随着时间延长,沉积的黑色颗粒逐渐增多聚集成团。②钙含量测定:随时间的进展,三组大鼠钙含量均逐渐增加,且DN+VDN组大鼠肾动脉组织各时间点钙水平较DN组显著升高,CON组大鼠较同期DN组明显下降(P<0.05)。3、免疫荧光检测BMP2/α-SMA和Runx2/α-SMA的表达:CON组大鼠肾动脉组织中可见BMP2及Runx2均少量表达且各时间点无明显变化;与同期CON组大鼠相比,DN组和DN + VDN组大鼠肾动脉组织BMP2及Runx2表达的绿色荧光强度相对较强,而α-SMA表达的红色荧光相对较弱;与DN组相比,DN +VDN组大鼠肾动脉血管中可见BMP2及Runx2蛋白的表达较同期DN组增加,α-SMA的表达减少;此外,随时间的推移,DN和DN + VDN组大鼠α-SMA的荧光强度也随BMP2或Runx2蛋白表达的增强而减弱。4、BMP2/Smad1/Runx2/Osterix信号蛋白免疫组化表达:CON组肾动脉组织中BMP2、Smad1、Runx2及Osterix在血管中膜均有散在微量表达。DN组大鼠肾动脉组织中可见BMP2、Smad1、Runx2和Osterix蛋白在实验8周末时表达即开始明显增加,阳性着色深,胞质呈棕黄色,主要分布于动脉血管中膜平滑肌细胞中,随时间的进展,表达逐渐增强。与同期DN组大鼠相比,可见DN+VDN组大鼠肾动脉组织BMP2/Smad1/Runx2/Osterix信号通路的表达明显升高。5、肾动脉组织BMP2及Runx2 mRNA的表达:RT-PCR结果示,对照组大鼠肾动脉组织BMP2、Runx2 mRNA仅有微量表达,且各时间点无统计学差异;模型组大鼠肾动脉组织自实验第8周末起,BMP2和Runx2 mRNA水平开始增加,16周末时BMP2及Runx2 mRNA的表达量达最高值,此外,与DN组相比,DN+VDN组同期大鼠表现出更高的BMP2和Runx2 mRNA水平(P<0.05)。6、肾脏HE染色显示:CON组大鼠各时间点未见明显异常;8周末时DN组大鼠可见肾小球体积增大,基底膜轻度增厚,系膜区增宽,肾小管上皮细胞偶见空泡样或颗粒状变性,随时间的延长,12周末时可见基底膜增厚更明显,偶见肾小动脉壁玻璃样变性,16周末时肾组织损伤进一步加重,基底膜重度增厚,并可见节段性硬化;与DN组相比,DN+VDN组同期大鼠上述病理改变明显加重。结论:1、DN在较早阶段时即已存在肾动脉等大血管的钙化,而在钙化血管中存在BMP2/Smad1/Runx2/Osterix信号通路的激活;2、肾动脉钙化的发生与严重程度与DN进展密切相关;3、BMP2/Smad1/Runx2/Osterix信号通路是DN肾动脉血管钙化重要的调节因素。