沙地柏种质生长和抗旱性状评价及特有Zn2+结合蛋白SvCML1功能研究

来源 :内蒙古大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:aswangxiao
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获得有明确生理功能的基因是作物分子育种的重要基础。丰富的野生植物资源是天然基因文库。现代高通量测序技术使开发野生植物基因资源成为可能。沙地柏是分布于我国干旱半干旱地区的柏科匍匐灌木,具有耐旱生、耐土壤贫瘠的生理特性,在我国北方生态绿化工程中广泛应用。本论文在收集我国北方沙地柏种质资源的基础上,对沙地柏种质进行了生长和抗旱性评价;进一步通过转录组测序技术,以期鉴定到沙地柏特有Ca2+结合蛋白编码基因,但是意料之外的是,我们发现了一个预测为含有Ca2+结合结构域的钙调素类蛋白SvCML1是Zn2+特异结合蛋白,对Sv CML1在植物Zn2+依赖生长方面的生理功能进行了探索。本研究工作主要内容和结论如下:(1)从内蒙古四个地区,以及甘肃、青海、陕西三个沙地柏原生态分布区,收集到总共221份种质资源,在扩繁基地生长3年半以后,对49个株系匍匐茎长度进行测量,每个株系至少取10株进行测量,并计算其平均值及标准差,结果表明来自陕西衡山、内蒙古陶利的沙地柏,生长最快,枝条长度1.5到2米;来自内蒙古贺兰山、甘肃天祝祁连山的沙地柏生长速度较慢,枝条长度0.5-1米。(2)2015年开始,分别对其中49个株系进行干旱处理6和11个月,同时以复水1个月以后材料为对照,收集扦插苗的地上部分进行抗旱指标的测定。每个株系,至少选择3株长势一致的枝条采样测量。对其枝条进行了脯氨酸(Pro)和丙二醛(MTA)含量测定,以及过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)酶活测定。基本抗旱能力判断依据为:在干旱处理条件下,Pro含量,SOD和POD活性,升高幅度越高,MDA含量升高幅度越低,植物越抗旱;反之,Pro含量,SOD和POD活性,升高幅度越小,MDA含量升高幅度越高,植物越干旱敏感。按照这个标准,大多数株系的四个指标之间没有明显规律,无法判断抗旱性。(3)具有明显抗干旱特征的株系包括来自内蒙古图克的#7,干旱处理以后,MDA没有显著升高,但是Pro含量和SOD酶活显著升高;来自内蒙古同德格尔的#30株系、内蒙古陶利的#8株系、陕西衡山的#5株系,干旱处理以后,MDA含量没有显著变化,但是Pro含量升高幅度在群体中位于前5位。(4)具有明显干旱敏感特征的株系包括来自内蒙贺兰山的#30株系和来自甘肃祁连山的#7株系:干旱处理以后,这两个株系的Pro含量、POD和SOD酶活都没有显著升高;但是,MDA含量升高幅度位于群体前2位。(5)以内蒙古陶利#8株系和内蒙古锡林浩特阿巴嘎旗的#2株系根为材料,进行了转录组测序。我们最初重点分析了沙地柏特有的编码Ca2+结合蛋白的基因,鉴定到Sv CML1,预测编码Ca2+结合钙调素类蛋白。但是,利用体外表达纯化的SvCML1蛋白和等温滴定分析技术,SvCML1被证实不是Ca2+结合蛋白,而是Zn2+特异结合蛋白。(6)SvCML1蛋白被发现定位于植物细胞内的内质网。在相对高【Zn2+】培养条件下,SvCML1提高了转基因拟南芥根组织和根细胞内质网内的Zn含量。(7)在拟南芥体内过量表达SvCML1使转基因植物在相对高【Zn2+】和低【Fe2+】培养条件下,表现生长被抑制的表型。低【Fe2+】显著诱导拟南芥根积累Zn2+;在低Fe2+条件下,SvCML1转基因植物根Zn2+含量显著高于野生型。降低培养基的【Zn2+】,可以完全恢复SvCML1转基因拟南芥的低【Fe2+】敏感表型。(8)SvCML1抑制编码Zn2+转运蛋白AtZIF2(Zinc-Induced Facilitator2,At2g48020)和AtMTP1(Metal Tolerance Protein1,At2g46800)基因的表达。以前的研究发现,缺失AtZIF2和AtMTP1基因的拟南芥突变体,在相对高【Zn2+】培养条件下,有生长受抑制的表型。(9)以SvCML1为诱饵蛋白,利用拟南芥酵母cDNA文库,进行了酵母双杂交实验,筛选得到SvCML1互作蛋白At CLC2(Clathrin Light Chain2,At2g40060)。缺失AtCLC2或其同家族基因AtCLC3(AT3G51890)的拟南芥,同SvCML1转基因拟南芥类似,在低【Fe2+】培养条件下,表现生长受抑制的表型。综上所述,在种质资源收集和生长、干旱性状评价的基础上,我们在沙地柏转录本中鉴定到一个编码钙调素类蛋白的基因,该蛋白体外实验和体内实验证明为Zn2+结合蛋白,具有提高植物Zn含量的功能,从多个途径调节植物Zn依赖的生长。本研究成果一方面对在生态绿化中沙地柏的应用提供了种质选择的力量依据,另一方面为通过分子育种改善作物Zn营养提供了具体的功能基因。
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