细菌性痢疾,简称菌痢,是全世界范围内流行的最常见的腹泻性疾病之一,亚洲每年感染志贺菌的患者接近1.25亿,死亡人数更是达到了1.4万[1]。在我国,志贺菌属仍然是感染性疾病中最为常见的病原体之一,每年约有一千多万人发病,住院病人达20万人次之多[2]。志贺菌属根据细菌外膜脂多糖的O-抗原结构差异可分为4个群,包括A群痢疾志贺菌(S.dysenteriae)、B群福氏志贺菌(S.flexneri)、C群鲍氏志贺菌(S.boydii)和D群宋内志贺菌(S.sonnei)。在发达国家,细菌性痢疾的致病菌以宋内志贺菌为主,而在发展中国家则以福氏志贺菌为主[3-6]。但是近几年来,菌群分布发生了变化,一些亚洲国家也开始流行宋内志贺菌[7,8]。抗生素应用是临床治疗细菌性痢疾有效而快捷的方法,然而近年来随着抗生素的广泛应用,临床不合理使用抗生素的现象十分常见,从而使菌株对抗生素的耐药性不断提高,多重耐药现象大量出现[9]。更令人担忧的是人口流动性的增加为志贺菌的传播提供了条件,使得各地区甚至是全世界范围内菌群分布和耐药性都发生了一定的变化。为了控制细菌性痢疾的蔓延及流行,进一步了解志贺菌多重耐药的机制,探索解决问题的途径迫在眉睫。本研究旨在对上海市2010~2014年分离自病人的382株志贺菌进行了生化、血清型鉴定及耐药性检测。了解志贺菌的耐药特征和耐药谱变化,并且对139株福氏志贺菌进行氟喹诺酮类抗菌药物敏感性降低的相关耐药基因的研究。同时对这些菌株在分子生物学方面做了进一步研究,包括毒力基因、遗传特点、基因差异等进行分析,具体研究内容包括以下几部分:首先对分离到的382菌株进行生化鉴定和血清分型。采用法国梅里埃API 20E生化鉴定试剂盒进行生化鉴定试验;采用日本生研(Denka Seiken)诊断血清进行血清学鉴定,结果宋内志贺菌243株,占63.6%,福氏志贺菌占36.4%。福氏志贺菌共检测到9种血清型,其中F2a是最主要的血清型(65/139,46.8%)。可见,近年来志贺菌的菌群分布有了变化,宋内志贺菌逐渐代替福氏志贺菌成为主要的流行株。同时血清型2a仍然在福氏志贺菌中占有主导地位。采用WHO推荐的改良K-B纸片法,对2010~2014年上海市382株志贺菌进行14种抗菌药物的敏感试验,抗菌药物包括氨苄西林(AMP)、环丙沙星(CIP)、头孢噻肟(CTX)、头孢吡肟(FEP)、复方新诺明(SXT)、左氧氟沙星(LEV)、阿莫西林/克拉维酸(AMC)、氯霉素(C)、头孢西丁(FOX)、萘啶酸(NA)、诺氟沙星(NOR)、链霉素(S)、四环素(TE)、磺胺复合物(S3),分析其耐药性特征。结果382株菌株对萘啶酸、链霉素、氨苄西林、四环素、复方新诺明和磺胺异恶唑的耐药率依次为97.4%?96.1%?84.4%?77.7%?77.2%和67.8%。92.7%的菌株至少对3种及以上的抗生素产生了耐药,6.3%的菌株对10~13种抗生素产生了耐药。同时存在氟喹诺酮类和第三、四代头孢的耐药株。值得引起关注的是,福氏志贺菌对各种抗菌药物的耐药性要普遍高于宋内志贺菌,特别是对临床首选药物氟喹诺酮类抗生素,如环丙沙星的耐药率达到了40.3%。可见志贺菌多重耐药情况严重且复杂,临床应加强检测和监测。以PCR法检测ipa H、ial、sen、set1A和set1B这5种毒力基因,382株志贺菌携带ipa H、ial、sen、set1A和set1B基因的阳性率分别为100%,65.7%,64.5%,34%and 34%;福氏志贺菌和宋内志贺菌分别有74.8%和60.5%携带ial基因;福氏志贺菌129株携带set1A和set1B基因,其阳性率达到了92.8%,而243株宋内志贺菌只有1株携带有set1A和set1B基因,阳性率仅为0.4%。可见福氏志贺菌携带的毒力基因要多于宋内志贺菌,而且毒力更强,我们应注意防范。采用PCR法检测DNA旋转酶A、B亚单位(gyr A、B)、拓扑异构酶IV C、E亚单位(par C、E)基因的喹诺酮类药物耐药决定区(QRDR),同时对质粒介导喹诺酮类耐药(PMQR)基因(qnr A、qnr B、qnr S)和氨基糖苷乙酰转移酶变异基因(aac(6’)-Ib-cr)进行筛选。扩增产物进行DNA测序。结果gyr A和par C基因的突变率分别为98.6%和97.8%。gyr A基因存在Ser83、Asp87和His211这三个位点的突变,Par C基因只检测到Ser80这一个位点的突变。所有环丙沙星敏感的菌株均未出现gry A基因的Asp87这一位点的突变。共检测到9株qnr S和6株aac(6’)-Ib-cr喹诺酮耐药质粒。可见,上海地区福氏志贺菌在QRDR区氨基酸的突变率极高。Asp87这个位点的突变对喹诺酮类抗生素的耐药起着主导作用。采用国际食源性监测网络Pulse Net推荐的PFGE标准方法对其进行基因分型,用Bio Numerics软件分析电泳图谱。139株福氏志贺菌共有97个带型,分成7个聚类,其中128株菌株为同一聚类,占92.9%,其相似度≥80.6%。243株宋内志贺菌共有138个型别,分成17个聚类,其中198株菌株为同一聚类,占81.5%,其相似度≥89.3%。可见,上海地区近几年所流行的志贺菌菌株进化来源于多个克隆,然而亲缘关系较近。根据warwick网站(http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/)数据库提供的7个管家基因位点进行PCR扩增,对各管家基因PCR产物进行碱基序列测定,与warwick数据库中序列进行对比,得到各菌株相应的序列型(sequence type,ST)。共检测到3种ST型,分别为ST245,ST145和ST628,除了4株福氏6型志贺菌属于ST145和1株福氏3a属于ST628,其他菌株都是ST245型,占96.4%。可见上海地区福氏志贺菌亲缘关系近,绝大多数的菌株的流行是以ST245型为主的克隆。