研究背景:　　 风湿热是A组β溶血性链球菌咽部感染后引起的一种自身免疫性疾病。风湿热反复发生可导致不可逆的慢性风湿性心瓣膜病，即风湿性心脏病(简称风心病)。风湿性心脏病是风湿热的一个严重后果，也是决定预后的最重要因素。由于近些年出现新的的链球菌菌株流行，导致风湿热和风湿性瓣膜病风湿活动的临床表现趋向于不典型。按照1992年修订的Jones标准及2002-2003年WHO风湿热及风湿性心脏病诊断标准，风湿热漏诊率仍较高。而且风湿热复发率高，复发次数越多形成风湿性心脏病的几率愈高，死亡率也随之增高，疾病的预后也越差。如何提高对不典型风湿热和瓣膜病风湿活动的早期诊断率，以便能够早期治疗，从而改善风湿热及风湿性心脏病患者的预后，是当前国际上备受关注的一个焦点问题。然而，迄今为止国内外尚无一项临床或实验室检查方法对风湿热的诊断具有特异性意义。超声心动图、心肌核素灌注显像诊断风湿性心脏炎必须结合实验室指标，否则特异性就无从说起。因此，寻找一种具有特异性的实验室方法显得非常迫切。本实验室是国内最早开展A组链球菌胞壁多糖的有关研究，曾一度在临床上开展了A组链球菌多糖抗体(antibody to cell wall polysaccharide of groupA streptococci，ASP)检测，研究结果提示ASP在诊断典型风湿热和不典型风湿热均有较高的敏感性和特异性。本实验室已经建立了一套较完整的多糖提取方法，但提取的多糖纯度及质量稳定性不是太理想，其中一个重要的原因是没有一个很好的质量控制方法。多糖化学结构复杂，对其结构尤其是高级结构的研究难度大。早在上世纪50年代，有关研究显示，A组链球菌细胞壁多糖足N-乙酰氨基葡萄糖和鼠李糖的复合体，然而对其高级结构的研究进展缓慢。近些年来随着现代仪器分析技术的发展，如紫外光谱、红外光谱、核磁共振波谱、质谱，在多糖高级结构方面取得了重要进展，但未见这些技术应用于链球菌细胞壁多糖的质量控制方面的报道。　　 研究目的:　　 探索稳定、重复性好的A组链球菌胞壁多糖纯化方法，利用近些年发展的新技术对提取的多糖进行进一步的质量标准控制。寻找敏感特异的抗A组链球菌胞壁多糖抗体(ASP)检测方法，为临床推广使用提供依据。并用病理金指标来评价ASP在诊断瓣膜病风湿活动中的作用。　　 方法:　　 大量扩增A组链球菌，超声破碎，收获细胞壁，亚硝酸法提取粗多糖。酶法去除杂质，凝胶层析分离多糖组分。苯酚一硫酸法收集吸收峰中间部分。Dot-ELISA法鉴定不同多糖组分的抗原性。对抗原性最强的组分采用凝胶色谱法进行纯度及分子量测定，红外线光谱法分析结构。多糖的提取纯化及分析鉴定均重复三次，以验证实验结果的重复性。　　 采集拟行换瓣术的风湿性心脏病患者术前、术后1周、术后3个月的血标本及切除的瓣膜组织，ASP检测结果与心瓣膜病理结果相比较。并收集退行性瓣膜病、冠心病、感染性心内膜炎、先天性瓣膜畸形等瓣膜病患者30例，系统性红斑狼疮、类风湿性关节患者30例，健康志愿者30例，共90例作对照，检测ASP的特异性。　　 采用SPSS13.0软件。定性资料的比较用X2检验，四格表中n<40，或至少存在一个Tij<1时，用Fisher确切概率法　　 结果:　　 粗多糖经凝胶层析法分离出4个峰，最具抗原性的多糖分子量为32000道尔顿，凝胶色谱法分析该组分成分较均一。红外线光谱分析该多糖以α-糖苷键连接，具有吡喃环、O-H、C-H、C=O键，不含蛋白质。实验重复三次，所得结果很相近。行换瓣术的风湿性心脏病患者共34例。这些患者临床上均诊断为风湿性心脏病风湿活动静止期，无急性期症状，除其中1例ASO、抗DNA酶B升高，另1例CRP升高外，其余患者的ASO、抗DNA酶B、血沉、C反应蛋白均为阴性，心脏超声、心电图未提示风湿活动。心脏病理显示有风湿活动的患者ASP阳性率为77.8％(7/9)，心脏病理无风湿活动的患者ASP阳性率为32％(8/25)，两者比较有统计学差异，(P值<0.05)。对照组有12例ASP阳性。　　 ASP诊断风湿性心脏病的敏感性为44.1％(15/34)，特异性为86.7％(78/90)，阳性预测价值为55.6％(15/27)，阴性预测价值为80.4％(78/97)。　　 在已确诊的风湿性心脏病患者中，ASP诊断风心病风湿活动的敏感性为77.8％(7/9)，特异性为68％(17/25)，阳性预测价值为77.8％(7/9)，阴性预测价值为68％(17/25)。ASP与病理检查的相关性分析显示，两种方法的结果存在正相关(P<0.05)，相关系数r为0.377。本研究首次在国内外获得该多糖的红外线特征性图谱。　　 结论:　　 亚硝酸法及凝胶层析法提取纯化多糖，红外线光谱分析作为质量控制方法，结果稳定，重复性好。Dot-ELISA法检测ASP简便、敏感、特异。ASP提示瓣膜病存在风湿活动具较高价值，与病理变化有较好的相关性，具有比ASO、抗DNA酶B、ESR、CRP、心电图、心脏超声无法比拟的优势。　　 研究背景:　　 急性风湿热是A组链球菌感染诱发的一种迟发性免疫反应，累及心瓣膜可引起瓣膜不可逆狭窄和/或关闭不全，即风湿性心脏病，是风湿热致死致残的最主要原因。风湿性心脏病的发病机制尚不完全清楚，但是A组链球菌在风湿性心脏病发病中的关键作用已经明确。目前较普遍的观点认为A组链球菌的某些组分与宿主心脏之间的分子模拟打破了宿主对自身抗原的免疫耐受而致病。已知链球菌M蛋白与心肌的肌球蛋白、层粘连蛋白分子结构非常相似。动物模型的建立对进一步探明风湿性心脏病发病机制及开发新的治疗策略意义重大。然而动物模型的建立多年来一直足个难题。据我们所知，风湿性心脏病的模型非常有限，至今尚无一种动物模型的病理改变与人类风湿性心脏病相似。1949年Murphy和Swift给兔注射活的GAS，诱导出瓣膜炎、心肌炎，但病变不是很典型，成功率较低，诱导周期长，而且缺乏有效的指标预测心脏炎的发生。瓣膜炎是风湿热最严重的并发症，但是近50年来未见有关风湿性瓣膜炎动物模型的成功报道。我们以往的研究证实了福尔马林灭活A组链球菌诱导风湿性心肌炎的可行性。本研究旨在采用福尔马林灭活的A组链球菌诱导一种新的慢性风湿性心瓣膜炎的Lewis大鼠模型。并以动物心脏病理对照，评价外周血促淋巴细胞活性及抗A组链球菌壁多糖抗体预示风湿性心脏炎发生的价值。　　 研究目的:　　 建立慢性风湿性心瓣膜炎动物模型，并以动物心脏病理对照，评价外周血促淋巴细胞活性及抗A组链球菌壁多糖抗体提示风湿性心脏炎的价值，为风湿性心脏病的诊断及研究提供有力手段。　　 实验方法:　　 1.实验动物：实验动物为七周龄Lewis雌鼠，分为A、B、C三组，每组8只。　　 2.抗原：抗原D为经福尔马林灭活、超声处理、完全弗氏佐剂乳化的A组链球菌混悬液，抗原E为福尔马林灭活、超声处理、未加免疫佐剂的A组链球菌混悬液。　　 3.诱导方法：A、B两组多次多部位皮下注射抗原D免疫大鼠，每7天一次，3个循环后给予抗原E。C组为对照组，采用同样方法注射弗氏佐剂及生理盐水。距第一次注射抗原12周后处死A组，24周后处死B、C组。　　 4.观察指标及实验室检查：观察动物体重、食欲、活动及足关节形态的变化情况。抽血行抗链球菌溶血素“O”(ASO)、抗DNA酶B、外周血促淋巴细胞活性(PCA)及抗A组链球菌壁多糖抗体(ASP)检查。切取心脏组织HE染色，进行病理检查。　　 5.统计学方法：采用SPSS13.0统计软件。定量资料用均数士标准差(-x±S)表示。Shapiro-Wilk检验进行正态性检验，方差齐性检验用F检验。正态分布方差齐的两个独立样本均数比较采用t检验，多个样本均数比较采用单因素方差分析。不符合正态分布的两样本采用Wilcoxon秩和检验，多个样本采用Kruskal-Wallis秩和检验。P<0.05为有统计学差异。　　 实验结果:　　 12周时3组动物的体重无明显差异，B、C两组在24周时的体重无明显差异(P>0.05)。首次于后足垫注射抗原后第1天，三组大鼠注射部位的关节均出现明显的红、肿、热，第2周A、B组动物可观察到非注射侧足部亦出现轻度关节红、肿、热现象，注射侧比非注射侧明显，第6周逐渐减退至消失。C组后足垫注射后第1天也出现关节红、肿、热，但不如实验组明显，非注射侧足部无关节红、肿、痛，第3周逐渐减退至消失。　　 三组大鼠体重A组大鼠分别有62.5％(5/8)及50％(4/8)发展为心肌炎和瓣膜炎，病理结果显示心肌及瓣膜灶性细胞浸润。B组分别有75％(6/8)及62.5％(5/8)发展为风湿性心肌炎和慢性瓣膜炎。病理学检查不仅有急性期损害如细胞浸润、类阿少夫细胞、疣状赘生物，也有慢性期病变如纤维化、血管新生。C组无一例发生心肌炎和/或瓣膜炎。　　 三组大鼠的血清ASO、抗DNA酶B检查均为阴性。A组中2例ASP阴性，其心脏病理检查未显示心脏炎改变；6例为阳性，心脏炎大鼠ASP均为阳性。B组均为阳性，C组多糖抗体均为阴性。ASP与病理检查这两种方法存在高度正相关(P<0.05)，相关系数为0.677。　　 结论:　　 本研究建立的Lewis大鼠慢性风湿性心瓣膜炎的模型病变典型，与人类风湿性心脏病的病变相似，造模成功率较高，可用于今后人类RHD的进一步研究。PCA和ASP在提示风湿性心脏炎的诊断方面具有较高的价值。