黄瓜(Cucumis sativus L．)原产喜马拉雅山南麓的印度北部地区，是一种世界性的重要蔬菜，为大众喜爱，有很高的营养价值。印度于3000年前开始栽培黄瓜。随着南亚民族的迁移和往来，黄瓜由原产地向东传播到中国南部，东南亚各国及日本等，在我国已有2000多年的栽培历史。黄瓜是喜温但不耐高温的一年生攀缘性草本植物，从播种出苗到采摘的时间较短，是最适合周年生产、均衡供应的一种瓜类。常用的植物遗传育种的原理与方法在提高黄瓜性状方面已失去了原有的优势，即长期通过表型值来估计育种值，使得性状的遗传进展越来越小。随着分子遗传学原理和生物技术方法的发展，从分子水平上对植物的生产性能进行改良有了可能，从而为植物分子育种打下基础。由于种内资源的有限，利用基因工程将是今后黄瓜品种改良中重组远缘有用基因的有效手段。对黄瓜基因进行研究，可为进一步的分子育种打下基础。黄瓜果实是其经济产品器官和食用部位，脆嫩、具有丰富的营养价值，它的生长发育过程、物质合成与积累、外部形态特征和内在品质性状等无不影响其产品器官的产量构成和经济价值。探讨黄瓜果实的生长发育特点，尤其是探讨黄瓜果实生长发育过程中的基因表达与调控方式，可以为今后改良黄瓜的结实习性、促进果实生长、提高经济产量和改善果实品质等方面奠定基础。本实验以黄瓜幼果为实验材料，以λTriplEx2为载体，构建了黄瓜cDNA文库，通过随机挑选部分克隆进行EST测序后，进行网上同源性比较和基因功能分析，得出以下结论： 一、黄瓜(Cucumis sativus L．)cDNA文库的构建 采用上海生工的Trizol试剂盒提取黄瓜的总RNA，1％琼脂糖凝胶电泳的结果显示：提取的黄瓜RNA的28s、18s、5s条带较为清晰，说明mRNA受分解的程度小。西南农业大学硕士学位论文 采用Promega公司的PofyATtrac必mRNA Isolation systemm从RNA中分离提取mRNA，经紫外分光光度计测定，mRNA纯度较高，能够满足实验的需要。 采用s以盯w 011即nucleotide和eosn仍’PeR Primer为引物，在助werscdPt侧Reverse Tn江巧criPtase酶的作用下合成第一链cDNA并进一步合成第二链cDNA，经PCR产物纯化和劝I酶切后用CHROMA SPIN礴00 colulnn柱进行分级分离以去除小于400bP的cDNA片段和一些核糖体RNA，浓缩回收后按比例与载体人TriplExZ(带有劝酶切末端)连接.采用stratagene公司的Gigapack⑧m Gofd一7 packaging extract试剂盒进行包装，获得cDNA文库。 包装产物中加入终浓度为7%的DMSO，分装后置于一80℃保存。二、文库质量的鉴定 将得到的cDNA原始文库按l:10的比例进行稀释，将文库的稀释液与XLI一Blue菌株的感受态细胞混匀，加入0.器的顶层培养基以及IPTG和x~gal，倒平板并在37℃下过夜培养，计算噬菌斑数目及蓝白噬菌斑数量。得出噬菌体cDNA文库的滴度为1.165xl咋五刀ml，重组率94.42%。根据载体的多克隆位点，用反oRI和从”dlll进行双酶切，得到该文库的大多数外源插入片段平均大小在50obP以上。采用相同方法测定cDNA扩增文库的滴度约为101。Pfi材inl。三、EST测序 从cDNA文库中随机挑选部分克隆，经及oRI和去打”dlll双酶切鉴定，进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示:大部分克隆都有外源片段的插入。本实验共测了141个阳性克隆，采用人TriplExZ载体多克隆位点胡IA端的pTrips‘sequenei吧primer(CTcCGAGATcToGAc)作为测序引物，即从。DNA的5‘端进行测序，去掉低质量EST序列后剩余139条，测序成功率为98.58%，全长序列有36条，占25.53%。最长的EsT为706bP，平均长度562.74bp，长度峰度在600bP左右，79.43%的EST长度集中在500~7oobPo四、测序结果分析 从分析结果看，EST序列中有部分序列为同一基因。这些序列经clusta1W软件比较后拼接形成一个新的序列。本实验共拼接出22个。139个EST经拼接共获得非重复序列116条，占8145%。经BLASTx与美国国立卫生研究院国家生物信息学研究所(NCBI)的Ge血日出玄 摘要公二二三二二留翻巴巴巴里曰吕曰皿数据库(httP://认四切刃.ncbi.nlm.nih.gov)中现存的ESTs进行同源分析后表明，所得到的139个ESTs序列中有133个在其中可以找到同源序列，其中97条(69.78%)与己知序列高度相似，36条(25.90%)为低度相似序列，在GenBank中未找到匹配同源序列的ESTs为6个 (4.32%)。获得104个(74.82%)己知基因，6个(4.32%)新基因，29个(20.86%)未知基因。在测定的134个ESTs中，核糖体蛋白基因ESTs最多为27个，占测定总数的19.42%。