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1,6-二氮杂萘母核是药物化学中应用非常广泛的一个结构骨架,基于1,6-二氮杂萘母核衍生的化合物具有良好的抗病毒、抗菌、抑制肿瘤细胞生长等多种生物活性。我们小组通过筛选第一代基于二氮杂萘核心结构的化合物库,首次发现8-氨基取代的1,6-二氮杂萘类化合物具有很好的抑制肿瘤细胞生长和酪氨酸激酶磷酸化的活性。因此,我们以1,6-二氮杂萘为核心骨架构建了聚焦性化合物库,设计合成了四类不同结构类型的5,8-二取代-1,6-二氮杂萘-7-羰酰胺类化合物,针对肿瘤发生发展中的多个重要酪氨酸激酶,系统开展了1,6-二氮杂萘衍生物作为新型多靶点酪氨酸激酶抑制剂的作用机制和结构优化研究。
前期研究获得的苗子化合物LNZ-56(论文中编号2-5)抑制MDA-MB435肿瘤细胞株生长的IC50为1.2μM:10μM浓度下对EGFR,c-Src激酶磷酸化的抑制率分别为59.2％和70.4%。以此为出发点,我们采取四个策略对5,8-二取代-1,6-二氮杂萘-7-羰酰胺类化合物进行结构改造,以进一步提高其抑制激酶和抗肿瘤活性。首先保留1,6-氮杂萘的5,8位取代基不变,对7位的羰酰胺结构进行修饰,考察苄胺的苯环上不同取代基的位阻效应、电性效应和亲脂性对活性的影响,包括各种卤素、烷氧基取代,同时我们还将苯环衍生为萘环、杂芳环,得到了一系列化合物。第二个策略是固定1,6.二氮杂萘的7位活性芳环结构,对5-位取代基进行优化,引入对ErbB-2酪氨酸激酶有较好抑制活性的Michael反应受体结构,如丙炔酸酯类结构(通常可以和巯基形成共价键的Michael反应受体)。第三个策略,考虑到EGFR受体在体内是以二聚体的形式发挥作用的,我们将1,6-二氮杂萘化合物在不同的连接位点以不同的Linker进行二聚,考察二聚体化合物活性是否能够提高。最后,我们保留5,8位取代基不变,对7位上的酰胺键进行电子等排体和骨架跃迁的结构改造,以磺酰胺、脲、氨基羰基等进行替换,考察对活性的影响。
我们将所合成的1,6-二氮杂萘系列化合物对四种酪氨酸激酶进行了活性测试,结果显示,在1,6-二氮杂萘的7位苯环3’位上引入吸电子基团如CF3,C1,同时在其邻对位引入给电子的脂溶性基团如OCH3等对提高化合物的活性是有利的,苯环的4’位引入噻吩或对甲苯磺酰胺的化合物2.16,2-23对EGFR、c-Src、KDR等多种酪氨酸激酶均有显著的抑制作用,为多靶点酪氨酸激酶抑制剂。在1,6-二氮杂萘的5位引入丙炔酸甲酯、β-酮酸酯的化合物均对c-Src、KDR激酶有良好的抑制作用,而且β-酮酸酯的引入使得化合物增强了对EGFR激酶的抑制活性。对于以第三个策略所合成的化合物,我们发现二聚化位点对活性很重要,如在1,6.二氮杂萘的8位进行二聚,化合物活性丧失,但在7位进行二聚,化合物则保持了对c-Src激酶的抑制作用;但是,7位以酰胺键为连接键置换为磺酰胺键为连接键的化合物则丧失了对EGFR、c-Src、KDR激酶的抑制作用。基于8-氨基-1,6.二氮杂萘-7-羰酰胺结构的化合物普遍显示对c-Src激酶显著的抑制活性,有30个化合物对c-Src激酶的Icso小于10μM,活性最好的化合物LNZ-92对c-Src激酶的IC50值为0.86μM。
所合成的1,6-二氮杂萘衍生物也进行了多种人癌细胞株的体外增殖抑制作用活性测定,大部分化合物显示了良好的抗肿瘤细胞生长的活性,在10μM浓度下对MDA-MB-435,SkBr-3,A375,A431,HT29等肿瘤细胞株的体外增殖的抑制率达到了90%。部分化合物对抑制肿瘤细胞生长的IC50达到了nM水平。不同取代的化合物则显示了对不同肿瘤细胞株的选择性抑制作用,
由于5,8-二取代-1,6-二氮杂萘-7-羰酰胺类化合物是一类新结构的酪氨酸激酶抑制剂,没有相关化合物的抗肿瘤活性和作用机制的文献报道,因此我们对其作用机理进行了探索。ATP竞争性实验显示我们的化合物是非ATP竞争性c-Src激酶抑制剂,功能实验显示此类化合物不能抑制c-Src激酶的自身磷酸化,但能抑制c-Src激酶的下游信号分子paxillin、FAK的磷酸化,而且呈现出明显的剂量效应。基于以上药理学数据,我们通过计算机分子模型预测了化合物与c-Src激酶的结合模式,我们初步认为5,8-二取代-1,6-二氮杂萘-7-羰酰胺类化合物是一类新型的变构抑制剂,不与激酶的ATP结合位点相互作用,只特异性地与激酶构象变化所暴露的“变构位点”相结合。
另一方面,我们在合成1,6.二氮杂萘-7-脲结构衍生物的过程中,得到了一类结构新颖的1,6-二氮杂萘并咪唑酮化合物,其中咪唑酮3位为3,4-二氯苄基的化合物3P-4对多个酪氨酸激酶有很好的抑制活性,尤其是对c-Met激酶,IC50为8.7μM。NIH3T3-TPR-Met细胞中c-Met磷酸化的功能性实验表明化合物3P-4能够明显抑制TPR-Met的磷酸化,确证1,6.二氮杂萘并咪唑酮类化合物能够靶向c-Met介导的信号通路,提供了一类新结构的c-Met激酶抑制剂。我们进而合成了一系列的1,6-二氮杂萘并咪唑酮类化合物,初步构效关系研究显示,咪唑酮3位芳香环4-C1或者3,4-二氯取代基的存在对保持c-Met激酶的抑制活性是必需的,但是,将咪唑酮1位1,4-反式环己二胺置换为环己烷的化合物则丧失了对c-Met激酶的抑制作用。