【背景】胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤，发病率和死亡率居高不下。胃癌的发生受多因素影响，其发病机制尚有待阐明。尽管早期诊断和新型治疗方法不断出现，但是进展期胃癌因生长迅速和高转移率，预后差，5年生存率低于20%。而目前临床上主要通过TNM分期、肿瘤组织学类型和淋巴结转移等临床病理特征对胃癌患者进行术前评估和预后判断的方式敏感性较低，且存在争议。因此，分析胃癌发生发展的相关分子机制，寻找新的胃癌早期诊断分子生物学指标和潜在治疗靶点，对改善胃癌预后和提高患者生存率具有重要意义。FOX转录因子家族是近年来发现的一类新的参与肿瘤发生发展的重要分子。FOX家族成员在胃癌中发挥的作用也吸引了众多研究者。已有研究发现，一方面，FOXC2、FOXM1和FOXQ1在胃癌中表达增高，FOXM1b可以促进血管内皮生长因子的活化和诱导胃癌血管的生成，提示其在胃癌中可能发挥促癌作用。另一方面，FOXD3在幽门螺杆菌感染诱导的超甲基化过程中下调，参与HP感染引发的胃癌；FOXO3a与RUNX3协同活化Bim，共同诱导胃癌细胞凋亡，提示FOXD3和FOXO3a可能参与抑制胃癌的发生。而其他FOX家族成员在胃癌发生发展中的作用仍不清楚。我们实验组主要研究FOX家族在胃肠道肿瘤和肝癌中的作用，并已发现，FOXM1和FOXC1可通过促进MMP-7、RhoC和ROCK1的表达或诱导EMT促进肝癌转移；FOXQ1可通过诱导EMT和募集巨噬细胞浸润发挥促癌作用并促进转移发生。FOXJ1作为FOX家族的成员之一，除了在胚胎发育和分化、纤毛形成、抑制自身免疫反应等生物学行为中起着重要的调控作用之外，近年来也发现FOXJ1在不同肿瘤的发生发展中发挥着不同的作用：一方面，FOXJ1在乳腺癌和卵巢癌中可能发挥抑癌作用；另一方面，也有研究报道FOXJ1在肝癌中可能发挥促癌作用。提示我们，FOXJ1在肿瘤中可能呈异质性表达，并在不同的肿瘤微环境中发挥不同作用。而FOXJ1在胃癌中的表达情况、作用机制和临床价值仍无研究报道。【目的】检测FOXJ1在胃癌组织中的表达变化情况，分析其表达水平与临床病理学特征以及患者预后之间的关系，探讨其潜在的临床价值；观察FOXJ1对胃癌恶性生物学表型尤其是转移表型的影响；探讨FOXJ1抑制胃癌转移的分子机制。为阐明FOXJ1在胃癌发生发展中的作用和机制，以及FOXJ1在胃癌诊断和治疗中的潜在价值奠定理论基础。【方法】1、收集105例胃癌及其相匹配的癌旁组织石蜡标本，定制组织芯片，利用免疫组化染色检测FOXJ1在胃癌组织和相应癌旁组织中的表达情况；收集7例手术切除新鲜冰冻胃癌及癌旁组织标本，利用Real-time PCR和Western blot从mRNA水平和蛋白水平验证免疫组化结果；2、根据免疫组化染色评分结果，统计分析FOXJ1表达水平与胃癌患者临床病理学特征之间的相关性；收集105例胃癌患者的随访资料，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，应用log-rank检验分析FOXJ1的表达与胃癌患者生存时间之间的关系；应用单因素和多因素COX回归模型分析影响胃癌患者生存的独立预后因素；3、购买40例胃癌与配对淋巴结转移灶芯片，利用免疫组化染色对比分析FOXJ1在发生转移的胃癌原发灶和相应淋巴结转移灶中的表达水平；4、利用Western blot检测FOXJ1在各胃癌细胞系和永生化胃黏膜上皮细胞系GES-1中的表达情况；根据检测结果，选取胃癌细胞系AGS、BGC823和永生化胃黏膜上皮细胞GES-1，以及高/低转移潜能胃癌细胞系MKN28M/MKN28NM和SGC7901M/SGC7901NM作为后续研究的细胞模型，利用成功包装的FOXJ1过表达慢病毒载体（LV-FOXJ1）和相应的对照载体（LV-control），分别感染AGS、BGC823、MKN28M和SGC7901M细胞，利用FOXJ1shRNA慢病毒载体（LV-FOXJ1-shRNA）和相应的对照载体（LV-shRNA-control），分别感染GES-1、MKN28NM和SGC7901NM细胞，经嘌呤霉素抗性筛选获得稳定感染细胞株AGS-FOXJ1、BGC823-FOXJ1、MKN28M-FOXJ1、SGC7901M-FOXJ1、GES-shFOXJ1、MKN28NM-shFOXJ1、SGC7901NM-shFOXJ1，并利用Real-time PCR和Western blot分别验证感染的有效性；5、利用MTT实验观察改变FOXJ1的表达对AGS、BGC823和GES-1细胞体外增殖能力的影响；6、利用裸鼠体内成瘤实验观察改变FOXJ1的表达对BGC823和GES-1细胞体内成瘤能力的影响；7、利用Array Scan VTI1700plus高内涵细胞分析系统、划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验研究FOXJ1对胃癌细胞的体外运动、迁移和侵袭能力的影响；8、利用裸鼠尾静脉注射内脏转移实验，结合活体成像技术，研究FOXJ1对高/低转移潜能胃癌细胞系MKN28M/MKN28NM体内转移能力的影响；9、利用Real-time PCR和Western blot从mRNA水平和蛋白水平分别检测FOXJ1对高/低转移潜能胃癌细胞系MKN28M/MKN28NM中MMP-2和MMP-9及其内源特异性活性调节因子TIMP2和TIMP1表达的影响；10、利用免疫组化染色检测FOXJ1与β-catenin在胃癌组织中的表达相关性；11、利用免疫荧光染色，检测过表达或干扰FOXJ1表达的稳转胃癌细胞亚系MKN28M-FOXJ1、MKN28NM-shFOXJ1中β-catenin表达部位的变化；12、利用Western blot检测FOXJ1对高/低转移潜能胃癌细胞系MKN28M/MKN28NM中β-catenin和磷酸化β-catenin表达的影响。【结果】1、FOXJ1在胃癌组织中的表达明显低于相应的癌旁组织免疫组化染色结果显示，FOXJ1在癌旁组织中主要定位于胞核，胞浆中也有表达，而在胃癌组织中FOXJ1主要定位于胞浆，且表达强度明显减弱。进一步统计分析发现， FOXJ1在105例癌旁组织中有99例表达呈阳性，表达阳性率为94.3%，而在105例胃癌组织中仅有51例表达呈阳性，表达阳性率为48.6%。FOXJ1在胃癌组织中的表达明显低于相应的癌旁组织，具有统计学差异（P<0.001）。利用Real timePCR和Western blot检测FOXJ1在7例新鲜胃癌组织及对应的癌旁组织中的表达情况，结果表明：7例胃癌组织中，有6例FOXJ1的表达明显低于相应癌旁组织，与免疫组化结果一致。2、FOXJ1的表达水平与胃癌分期和转移密切相关根据免疫组化评分结果统计分析提示，FOXJ1的表达水平与胃癌的浸润深度（P<0.001）、TNM分期（P=0.039）、淋巴结转移（P=0.003）及远处转移（P=0.029）密切相关，即TNM分期越高、浸润深度越深、出现淋巴结转移或远处转移的胃癌病例，FOXJ1的表达越低。3、FOXJ1的表达水平与胃癌患者预后密切相关，并可作为胃癌患者的独立预后因素Log-rank生存分析结果提示，与FOXJ1阳性患者相比，FOXJ1阴性患者的生存时间明显缩短（P=0.037）；单因素和多因素COX回归模型分析提示FOXJ1表达水平与TNM分期、淋巴结转移及远处转移可作为影响胃癌患者生存的独立预后因素。4、FOXJ1在淋巴结转移灶中的表达水平明显低于胃癌原发灶免疫组化结果显示，在40例胃癌原发灶中，FOXJ1主要在胞浆中呈中等强度或弱表达，而在相应淋巴结转移灶中仅呈现非特异弱表达；同时FOXJ1阴性表达的患者多倾向于出现淋巴结转移，FOXJ1在淋巴结转移灶中的表达明显低于相应的胃癌原发灶（P=0.005）。5、FOXJ1在胃癌细胞系中的表达下调FOXJ1在胃癌细胞系MKN28、MKN45、SGC7901、AGS、BGC823中的表达水平明显低于永生化胃黏膜上皮细胞系GES-1，而FOXJ1在高转移潜能胃癌细胞系MKN28M、SGC7901M和GC9811P中的表达也明显低于相应的低转移潜能胃癌细胞系MKN28NM、SGC7901NM和GC9811。6、FOXJ1可抑制胃癌细胞的体内外增殖能力MTT结果显示，上调FOXJ1的表达可降低AGS和BGC823细胞的体外增殖能力，而下调FOXJ1的表达可以增强GES-1细胞的体外增殖能力；裸鼠体内成瘤实验显示，过表达FOXJ1可抑制BGC823细胞的体内成瘤能力，而干扰FOXJ1的表达可促进GES-1细胞的体内成瘤能力。7、FOXJ1可抑制胃癌细胞的体外运动、迁移和侵袭能力以及体内转移能力高内涵分析结果显示，上调FOXJ1的表达可减弱高转移潜能胃癌细胞系的体外运动能力，而下调FOXJ1的表达则增强低转移潜能胃癌细胞系的体外运动能力；划痕实验以及Transwell迁移和侵袭实验结果显示，上调FOXJ1的表达可抑制胃癌细胞的迁移和侵袭，而下调FOXJ1的表达可促进胃癌细胞的迁移和侵袭；裸鼠尾静脉注射内脏转移实验结合活体成像分析结果显示，过表达FOXJ1的MKN28M-FOXJ1细胞在裸鼠体内形成转移的光学信号强度明显减弱，且在裸鼠体内的转移率降低，肝脏表面形成转移结节数减少，而下调表达FOXJ1的MKN28NM-shFOXJ1细胞在裸鼠体内形成转移的光学信号强度显著增强，且在裸鼠体内的转移率升高，肝脏表面形成转移结节数增加。8、FOXJ1可抑制胃癌细胞系中MMP2和MMP9的表达，并促进胃癌细胞系中TIMP1、TIMP2的表达Real time PCR和Western blot结果显示，过表达FOXJ1可以显著降低高转移潜能胃癌细胞系MKN28M中MMP2、MMP9的表达，并增强TIMP1、TIMP2的表达，而干扰FOXJ1的表达可明显增加低转移潜能胃癌细胞系MKN28NM中MMP2、MMP9的表达，并降低TIMP1、TIMP2的表达。9、FOXJ1可能通过Wnt/β-catenin通路发挥作用免疫组化结果发现，在105例胃癌组织中，有50例胃癌组织呈β-catenin核表达阳性，与FOXJ1共定位统计分析提示，FOXJ1与β-catenin核表达在胃癌组织中呈负相关（相关系数为-0.228，P＝0.003）；免疫荧光染色结果发现，下调FOXJ1可使MKN28NM细胞中β-catenin在细胞浆中聚集，并在细胞核内出现β-catenin表达；而上调FOXJ1可减少MKN28M细胞胞浆中β-catenin的聚集，并抑制β-catenin发生核转位；Western blot检测结果显示，FOXJ1对各亚系细胞内总β-catenin的影响不大，但是下调FOXJ1可降低MKN28NM细胞中β-catenin的磷酸化水平，而上调FOXJ1可增强MKN28M细胞中β-catenin的磷酸化水平。【结论】1、FOXJ1在胃癌组织中表达减弱，且FOXJ1在胃癌中的下调与肿瘤浸润深度、TNM分期、淋巴结转移及远处转移密切相关；FOXJ1的表达水平与胃癌患者生存时间呈正相关，并可作为影响胃癌患者生存的独立预测因素。提示FOXJ1有望作为临床诊断胃癌的新的分子标志物和治疗靶向。2、FOXJ1在淋巴结转移灶中的表达减弱，且FOXJ1阴性表达的患者多倾向于发生淋巴结转移；体内外实验证实，FOXJ1参与抑制胃癌细胞增殖、侵袭、迁移等多种恶性生物学行为。3、FOXJ1可能通过增强TIMP1、TIMP2的表达抑制胃癌细胞中MMP9和MMP2的活性，减少细胞外基质降解；通过抑制β-catenin在胃癌细胞胞浆内的聚集和核转位，抑制Wnt通路激活，进而抑制胃癌细胞侵袭和转移。