牛病毒性腹泻（BVD）是由牛病毒性腹泻病毒（BVDV）引起的一种以急性发热、腹泻、母牛流产等临床症状的接触性传染病。目前已呈全球性流行,我国自1980年首次在国内发现BVDV的感染后,该病毒已在国内多个省份被检测到。农业部已将BVDV定为三类疫病,OIE也将BVDV设为B类传染病。由于全球经济合作交流日益密切,使得国内BVDV的感染出现了许多新的基因型和基因亚型,这给BVDV的防控造成了巨大的困难。并且由于BVDV的疫苗只能对同源毒株产生保护,而无法对同一个基因型中的所有亚基因毒株都产生有效保护。因此,了解国内BVDV感染情况和流行趋势,不仅可以进一步丰富国内BVDV流行病学数据库,还可以为BVDV的防控提供数据支持。研究材料方法:本研究针对BVDV的保守基因5’-UTR设计Taq Man探针,建立了一种高效、特异的BVDV1型荧光定量RT-PCR检测方法,并应用该方法对我国9个省采集的样品进行检测,并利用设计的测序引物对部分阳性样品进行测序获得5’-UTR基因和NPro基因,基于这两个基因进行分析,以期了解BVDV在国内的流行情况以及流行趋势。本研究对E2蛋白的理化性质、抗原指数、亲疏水性等进行分析,通过截取抗原指数高、亲水性好的154aa-340aa氨基酸片段利用原核表达系统进行E2蛋白的截短表达,以期为后续制备针对E2蛋白的单克隆抗体提供必备材料。1.BVDV1型荧光定量RT-PCR检测方法的建立:建立了TaqMan探针荧光定量RT-PCR,能够特异的检测BVDV1。建立的此方法最低检测极限为4.3copis/μL,重复性变异系数不超2%,标准曲线方程为y=49.712-3.227x,R~2=0.999,扩增效率E=104.1%,并可应用于临床样品的检测。2.BVDV分子流行病学调查:使用所建立的BVDV1型荧光定量RT-PCR方法对采集自国内9个省份的1432份临床样品进行检测,检测结果表明9个省份总体阳性率为14.73%,其中河北阳性率最高为39.85%;利用设计的测序引物对部分阳性样品进行5’-UTR基因和NPro基因扩增,经扩增后测序共获得72条5’-UTR基因序列和29条NPro基因序列,经与Gene Bank中的BVDV参考基因进行同源性比对后,结果显示72条5’-UTR基因之间的核苷酸相似性介于80.5%～100%之间,表明所获得的序列为同源序列的可能性较高,与BVDV1、BVDV2、BVDV3等基因型的参考毒株序列同源性介于69.4%-90.1%之间,其中与BVDV1的同源性最高,表明所获得序列与BVDV1参考毒株序列为同源序列;29条NPro基因核苷酸相似结果显示29条序列间的核苷酸相似性介于81.3%～100%之间,与BVDV1各基因亚型间的核苷酸相似性介于78.3%～97.6%,而与BVDV2各基因亚型的核苷酸相似性介于67.4%～70.3%。按照同源性分析结果构建5’-UTR基因和NPro基因进化树,结果显示NPro基因所构建的进化树与5’-UTR基因构建的进化树对所扩增得到的序列分型结果一致。通过5’-UTR基因的进化树结果可见,本次研究得到的72条5’-UTR基因序列有68%（49/72）序列属BVDV1a亚基因型、24%（17/72）序列属BVDV1c亚基因型、5%（5/72）序列属BVDV1q亚基因型、1%（1/72）属BVDV1m型,说明我国BVDV流行情况复杂,多种亚基因型都存在感染。3.E2蛋白截短表达:成功构建了pET-28a/E2原核表达重组质粒,利用BL21（DE3）原核表达系统进行原核表达,成功表达出E2的截短蛋白,表达蛋白分子量为25k Da,以包涵体形式表达,经纯化和复性后,使用BVDV阳性牛血清作为一抗,HRP标记的兔抗牛Ig G作为二抗进行WB试验,结果表明该重组蛋白有良好的免疫原性。综上所述,本研究通过建立的BVDV荧光定量RT-PCR检测方法对国内9个省份的临床样品进行BVDV检测,并扩增得到5’-UTR和NPro基因进行分析,结果显示国内牛群感染BVDV情况较为普遍,通过进化树分析结果显示国内BVDV流行趋势较为复杂,但并未发现新的亚基因型毒株感染。成功利用原核表达系统表达了E2截短蛋白并成功纯化,为后续研究提供了必备材料。