论文部分内容阅读
谷胱甘肽-S-转移酶是具有解毒功能的三大酶系之一。它们能够催化还原型谷胱甘肽的硫醇基团与各种亲电化合物相结合，增加内源和外源有毒物质的可溶性而利于其排出体外。除了解毒作用，谷胱甘肽-S-转移酶也参与胞内物质转运、激素的合成、细胞氧化应激损伤的保护，并在癌症化学治疗保护和药物抗性中发挥重要功能。另外，其多态性还与疾病易感性相关。昆虫中，谷胱甘肽-S-转移酶在杀虫剂解毒和抗药性的形成环节起着重要作用。
有机磷在防治鳞翅目害虫中发挥了重要功效，但随着有机磷的大量施用，昆虫抗性也日益加剧。家蚕作为鳞翅目昆虫的模式生物，研究家蚕谷胱甘肽-S-转移酶的表达模式和调控机制，为阐明谷胱甘肽-S-转移酶与杀虫剂抗性的关系，防治农林害虫有着重要的理论和实践意义。为了解谷胱甘肽-S-转移酶在家蚕中的表达情况和作用，更好的阐明昆虫抗药性产生的机理，本文采用生物信息学分析方法，依据家蚕基因组数据库和EST数据库信息，预测到家蚕的两条谷胱甘肽-S-转移酶基因BmGSTz2和BmGSTd3。参照EST拼接结果，设计扩增引物对其克隆并做了详细的序列分析，采用TR-PCR方法分析了其组织表达特性和有机磷应激反应模式，最后，用原核表达系统对BmGSTz2基因进行外源过量表达。获得结果如下：
1BmGSTz2和BmGSTd3的克隆和表达模式分析克隆的BmGSTz2和BmGSTd3基因(NCBI登录号：EF565386&DQ355374)的完整编码区序列长度分别为651bp和663bp。表达模式分析表明：BmGSTz2和BmGSTd3基因都有表达。其中BmGSTz2基因在脂肪体中的表达最高，在血淋巴、头、丝腺、表皮和卵巢5个组织中表达较低，而在中肠和精巢中没有检测到表达。BmGSTd3基因在血淋巴等8个组织中均有表达，其中在中肠和表皮的表达丰度较高，而在血淋巴的表达量相对较低。辛硫磷应激反应过程中，BmGSTz2基因的转录水平总体而言受到诱导，BmGSTd3基因转录水平相对保持不变。
2BmGSTz2和BmGSTd3基因结构和调控元件BmGSTz2基因由5个外显子与4个内含子组成且所有的外显子/内含子拼接边界均符合典型的GT-AG规则，位于nscaf2888上，外显子总长度为829bp，内含子总长度为18652bp，最长内含子为13942bp。BmGSTd3基因由5个外显子与4个内含子组成且所有的外显子/内含子拼接边界均符合典型的GT-AG规则，位于nscaf2279上，外显子总长度为938bp，内含子总长度为5442bp，最长内含子为3243bp。两者都含有大肠杆菌稀有密码子。转录调控元件分析结果：BmGSTz2基因的5’UTR长945bp，共发现了15个可能的转录调控元件，分别是：XRE(1)、ARE(3)、TRE(8)和NF-kB(3)；BmGSTd3基因的5’UTR长831bp，并且在5’UTR中存在2个内含子插入，共发现了12个可能的转录调控元件，分别是：XRE(2)、ARE(4)、TRE(5)和NF-kB(1)。
3BmGSTz2和BmGSTd3的推导氨基酸序列分析序列相似性分析结果：BmGSTZ2与其他物种Zeta家族成员的一致性在38.7％～43.9％之间，与Epsilon家族成员为15.1％～21.2％，与Dlata家族成员为13.3％～20.5％，与Theta家族成员为16.4％～19.9％。BmGSTD3与其他物种Delta家族成员的一致性在35.0％～51.3％之间，与Epsilon家族成员为30.7％～37.3％，与Theta家族成员为18.4％～23.9％，与Zeta家族成员为15.1％～19.2％。系统发生树的分析结果：BmGSTZ2属于Zeta家族，而BmGSTD3属于昆虫特异的Delta家族。蛋白质理化性质预测结果：BmGSTZ2的分子量大小为24.7kDa，等电点(pI)是8.56，有S28、S175、T41、T81、T141、T208、Y49、Y133、Y200共9个潜在的磷酸化位点；BmGSTD3基因产物的分子量大小为24.7kDa，等电点(pI)是5.15，有S82、S84、S161、S167、S175、T56、Y149、Y196共8个潜在的磷酸化位点；两者都属于非分泌型蛋白。蛋白质二级结构预测结果：BmGSTZ2和BmGSTD3都包含N-末端和C-末端两个结构域，N-末端由β-α-β-α-β-β-α共7个结构基序组成，而C-末端则由5个α螺旋构成，没有β折叠结构，两者都有一个保守的Ser催化位点。
4BmGSTz2基因的原核表达以pET-28a(+)为表达载体，将BmGSTz2基因完整编码区亚克隆到pET-28a(+)表达载体构建成重组表达质粒，转化到BL21(DE3)表达菌株，挑取单菌落扩大培养至OD600值至0.6～0.8时，用终浓度为1mM的IPTG，分别在20℃和37℃250rpm诱导5h，经SDS-PAGE电泳检测，与对照比较目的基因出现约27kDa左右的诱导蛋白带，证明该基因编码的蛋白质得到表达。