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第一部分RET、CXCR4在先天性肠无神经节症患者结肠组织不同肠段中的表达特点及意义目的：研究RET、CXCR4在先天性肠无神经节细胞症患者痉挛段、扩张段、正常段(吻合口部位)中的表达模式和分布特点,并与正常结肠组织的表达和分布进行比较,初步探讨RET和CXCR4在先天性肠无神经节细胞症发生及临床分子诊断中的作用。方法：收集先天性肠无神经节细胞症患者结肠组织61例,正常结肠组织6例；qPCR检测RET、CXCR4mRNA在先天性肠无神经节细胞症患者结肠组织不同肠段的表达水平；Western blot检测RET、CXCR4蛋白在先天性肠无神经节细胞症患者结肠组织不同肠段的表达水平;免疫组织化学、免疫荧光检测RET、CXCR4蛋白在先天性肠无神经节细胞症患者结肠组织不同肠段和正常结肠组织的表达分布和定位。结果：1)先天性肠无神经节细胞症结肠组织痉挛段RET、CXCR4mRNA表达水平较正常段和扩张段显著降低(P<0.01,n=57),正常段与扩张段组间比较无统计学差异(P>0.05,n=57)：2)先天性肠无神经节细胞症结肠组织痉挛段RET蛋白和CXCR4蛋白表达水平较正常段和扩张段显著降低(P<0.01,n=57)；3)在正常结肠和先天性肠无神经节细胞症患者结肠组织正常段和扩张段,RET和CXCR4蛋白主要表达于神经节内神经节细胞,CXCR4除了表达于神经节内神经节细胞外,神经节内的施旺细胞也有表达。痉挛段未见神经节或神经节发育异常,RET和CXCR4蛋白表达明显减少;4)免疫荧光双标显示,在有神经节存在的正常结肠组织和先天性肠无神经节细胞症患者结肠组织正常段、扩张段,CXCR4主要表达于整个神经节部位,而RET主要表达于零散分布于神经节部位的神经节细胞,RET、CXCR4共表达于神经节细胞。在神经节细胞缺乏的痉挛段,未检测到显著的RET和CXCR4共表达。结论：RET、CXCR4表达于人体结肠组织神经节部位的神经节细胞,两者在先天性肠无神经节细胞症患者痉挛段表达水平显著低于正常段。RET、CXCR4在正常结肠和先天性肠无神经节细胞症患者不同肠段的表达模式和分布的差异,提示其可以作为HSCR的一个临床分子诊断指标用于临床诊断。第二部分构建表达RET基因RNA干扰片段的重组腺病毒目的：构建表达RET基因RNA干扰片段的重组腺病毒,通过RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术下调RET基因表达,并验证重组腺病毒对RET基因的沉默效率。方法：采用DNA重组技术将靶向RET基因的RNA干扰片段定向克隆于腺病毒穿梭质粒pSES-HUS,再通过同源重组的方法,将其与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy共转染于BJ5183细菌获得可表达RET基因siRNA的重组腺病毒质粒,经脂质体转染HEK293细胞包装获得高滴度腺病毒,最后将重组腺病毒转染神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y,通过RT-PCR、Western-blot方法验证其对RET基因沉默的效果。结果：1)成功构建表达RET基因RNA干扰片段的重组腺病毒穿梭质粒pSES-siRET-site1、2、3以及阴性对照质粒pSES-siRET-scrambled;2)通过同源重组方法成功制备重组腺病毒质粒pAd5-siRET-site1、2、3、并包装收获高滴度腺病毒Ad5-simRET;3) RT-PCR、 Western blot均证实收获的腺病毒Ad5-simRET能够有效抑制RET的表达。结论：成功制备表达RET基因RNA干扰片段的重组腺病毒Ad5-simRET,并证实腺病毒Ad5-simRET能够有效抑制RET的表达,为下一步研究奠定基础。第三部分RET/CXCR4通路对神经嵴衍生细胞迁等生物学行为调控的作用及机制目的：通过重组腺病毒Ad5-simRET转染原代培养的迷走神经嵴干细胞(VNCSCs)和神经嵴来源的神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y下调RET表达,研究RET表达下调对CXCR4表达的影响,以及抑制RET/CXCR4通路对神经嵴衍生细胞迁移等生物学行为的影响。方法：原代培养并鉴定小鼠迷走神经嵴干细胞,并将重组腺病毒Ad5-simRET转染原代培养的迷走神经嵴干细胞和神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y下调RET表达;qPCR、Western blot检测RET表达下调后CXCR4、Etv4/5mRNA和蛋白表达水平的变化；MTT分析RET表达下调对VNCSCs和SH-SY5Y细胞增殖的影响；流式细胞术分析RET表达下调对VNCSCs和SH-SY5Y细胞凋亡的影响；Transwell、Matrigel Biocoat Invasion Chambers Insert系统分析RET表达下调对VNCSCs和SH-SY5Y细胞迁移和侵袭能力的影响。结果：1)成功原代培养VNCSCs,并鉴定其干细胞特性和多向分化能力；2)重组腺病毒Ad5-simRET能够高效转染原代培养的迷走神经嵴干细胞和神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y,并能有效抑制RET的表达；3)通过qPCR、Western blot证实RET下调可抑制CXCR4、Etv4/5mRNA和蛋白表达；4)与空白对照组和阴性对照组相比,转染Ad5-simRET后,VNCSCs和SH-SY5Y的增殖明显受到抑制,但对其凋亡无明显影响；5)转染Ad5-simRET后,VNCSCs和SH-SY5Y细胞迁移能力较空白对照组和阴性对照组均明显受到抑制,CXCR4抑制剂AMD3100也能有效抑制VNCSCs和SH-SY5Y细胞向SDF-1的趋化能力;6) VNCSCs和SH-SY5Y细胞转染Ad5-simRET后,细胞侵袭能力较空白对照组和阴性对照组均明显降低。结论：下调VNCSCs和SH-SY5Y细胞RET基因的表达能够抑制CXCR4、Etv4/5等分子的表达,抑制RET/CXCR4通路能够抑制神经嵴衍生细胞的增殖、迁移、侵袭能力。第四部分Ret/Cxcr4通路介导神经嵴干细胞迁移在小鼠肠神经系统发育中的作用目的：研究小鼠胚胎发育不同时期(E11.5～PN10) Ret、Cxcr4在肠道组织的表达水平的变化特点和表达定位情况,通过尾静脉注射RET基因RNA干扰质粒下调RET基因表达,探讨Ret/Cxcr4通路介导神经嵴干细胞迁移在小鼠肠神经系统发育中的作用。方法：通过qPCR、Western blot检测Ret、Cxcr4mRNA和蛋白在不同发育时期的小鼠胚胎肠道组织中的表达水平,免疫荧光检测Ret、 Cxcr4蛋白在发育中的小鼠胚胎肠道组织中的表达的定位情况；通过尾静脉注射Ret基因RNA干扰质粒下调Ret基因表达；P75/Ret免疫荧光染色标记肠神经嵴干细胞,通过计数不同肠段肠神经嵴干细胞的数量,分析抑制Ret/Cxcr4通路对小鼠肠道神经嵴干细胞在肠道迁移的影响。结果：1) qPCR结果显示,在肠神经系统发育早期,也就是肠神经嵴干细胞在肠道迁移、增殖、定植的关键时期(E11.5-E15.5),肠道组织Ret、Cxcr4mRNA表达水平显著性地高于肠神经系统发育后期,表达水平随肠神经系统发育呈逐渐下降趋势；2)Western blot结果提示,不同发育阶段Ret和Cxcr4蛋白表达模式与mRNA表达水平的变化基本一致；3)孕鼠尾静脉注射Ret基因RNA干扰质粒跨过胎盘组织后,能够有效下调胚胎肠道组织Ret的表达；4)P75/Ret免疫荧光标记的神经嵴干细胞计数结果提示,通过尾静脉注射Ret基因RNA干扰质粒抑制Ret/Cxcr4通路能够抑制肠道神经嵴干细胞在肠道中的迁移。结论：肠神经嵴干细胞在肠道迁移的关键时期肠道组织Ret、Cxcr4mRNA表达水平显著性地高于肠神经系统发育后期,表达水平随肠道神经系统发育呈逐渐下降趋势；抑制Ret/Cxcr4通路能够抑制肠道神经嵴干细胞在肠道中的迁移,提示Ret/Cxcr4通路在肠神经系统发育中发挥重要的作用。