论文部分内容阅读
目的脓毒症是严重创伤、感染及大手术等多种应激状态时的常见并发症，其发病率和死亡率居高不下。随年龄增长，老年人患脓毒症的机率明显增加，更易发生多器官功能衰竭，其中肺脏损伤和心功能不全在脓毒症早期就可出现，并且与预后密切相关。已有研究表明，脓毒症时TNF-α和NO水平明显上升，但两者在肺脏、心脏中的损伤作用及其机制仍未清楚。本研究旨在了解脓毒症时TNF-α、NO与器官损害的关系，并进一步分析脓毒症时各型NOS在心脏的表达及NO发挥作用的细胞内信号转导机制。材料和方法1．以青年雄性Wistar大鼠和D-半乳糖致衰老Wistar大鼠为研究对象。通过腹腔注射LPS（Escherichia coli 055:B5，脂多糖）10mg／kg，建立脓毒症模型。分别在注射脂多糖后2h、6h观察青年组和D-半乳糖组大鼠的整体反应、心肝肺肾的病理改变和血清生化指标（BUN、Cr、AST、ALT、CK、CKMB）的改变，并进行血气分析和测定心肝肺肾组织TNF-α含量、血清中TNF-α和NO的含量。2．应用多导生理仪监测大鼠心功能的变化；用分光光度计法测定青年大鼠心肌组织总一氧化氮合酶、组成型和诱导型一氧化氮合酶的活性；用RT-PCR、Western Blotting对大鼠心肌组织各型NOS的表达进行半定量分析；应用免疫组织化学方法对各型NOS在心脏中的表达进行定位分析。3．应用常规酶解法分离得到单个钙耐受的青年大鼠心室肌细胞，采用IonOptix单细胞动缘探测系统同步检测心肌细胞收缩及钙瞬变。心肌细胞依次给予S-亚硝基-N-乙酰青霉胺（NO供体）、美兰（鸟苷酸环化酶阻断剂），并在电场刺激下观察不同处理因素对心肌细胞收缩／舒张指标（最大收缩幅度、最大缩短速率、最大舒张速率、收缩／舒张时程）和心肌细胞钙瞬变指标（基础状态下荧光强度、荧光强度变化幅度）的影响。4．统计学处理数据用（?）±S表示。应用GraphPad Prism-4.0进行作图和统计分析。统计学差异用方差分析或t检验，P＜0.05表示有统计学意义。结果1．腹腔注射LPS后，青年组和D-半乳糖组大鼠均可出现全身反应如体温升高，呼吸急促，精神萎靡、懒动、对刺激反应差，多数出现稀便，口唇肢端紫绀，鼻翼扇动、流涕。D-半乳糖组大鼠的症状和体征普遍较青年组严重，NS组无明显改变。肺脏在给予脂多糖后2h即可有明显病理和血气改变，心肝肾病理及生化指标在6h改变明显，在同一时相点D-半乳糖组大鼠均较青年鼠严重。肺、心、肝、肾组织的TNF-α含量2h时达高峰，以D-半乳糖大鼠肺脏升高最为明显。血中NO水平明显上升，以6h幅度最大。2．给予LPS6h后大鼠心脏收缩和舒张功能下降(±dp／dtmax)，心脏中iNOS的活性明显升高，cNOS活性减弱；RT-PCR和Western Blotting结果显示，给予LPS6h后心脏中eNOS和nNOS的表达减少；基础状态下iNOS表达量极少，给予LPS后表达量明显增加。免疫组织化学定位显示：给予LPS后内皮细胞和心肌细胞上eNOS表达减少，心肌细胞上nNOS表达减少、iNOS表达增多。3．单细胞动缘探测系统观察到：给予外源性NO供体后心肌细胞的收缩／舒张幅度指标（最大收缩幅度、最大缩短速率、最大舒张速率）均明显下降；钙瞬变指标也下降；上述抑制作用可被鸟苷酸环化酶阻断剂（美兰）减弱。结论1．腹腔给予LPS后，脓毒症大鼠肺脏损伤出现最早，而且在相同致伤条件下，D-半乳糖组大鼠较青年鼠脏器受损更严重，这可能与D-半乳糖组大鼠肺脏TNF-α水平较高和诱导生成的NO水平较高有关。2．脓毒症时，iNOS、nNOS和eNOS的表达和活性发生改变；其中心肌细胞上iNOS表达及活性升高可能在心功能降低中发挥作用。3．外源性NO可以降低单个心肌细胞的收缩／舒张幅度和钙瞬变，该作用可能主要通过一氧化氮-环磷酸鸟苷途径完成的。