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背景缺血性脑卒中是世界上致死致残的重要原因之一,目前临床用药十分匮乏。内源性神经干细胞的存在为治疗缺血性脑卒中带来新希望。成体神经干细胞被证明主要位于侧脑室室管膜下区（SVZ）的特殊小生境（niche）中,是脑缺血损伤后新生神经元的主要来源。如何有效促进内源性神经干细胞增殖分化,并迁移到损伤区域存活下来,成为治疗脑卒中的关键。梓醇是传统中药地黄的主要有效成分之一,研究提示梓醇具有抗炎,抗细胞凋亡,促血管新生和神经保护等多种药理活性。课题组前期发现,梓醇促进脑缺血大鼠成体神经干细胞增殖分化,促进缺血周围皮质血管新生,但作用机制有待进一步阐明。多项研究表明,基质细胞衍生因子-1（SDF-1）及其受体CXCR4参与脑缺血后神经血管修复,结合分子对接预测结果,本课题提出梓醇可能通过激活SDF-1/CXCR4信号通路调控SVZ区神经干细胞增殖迁移分化过程;梓醇可能通过促进缺血周围皮质区域血管新生分泌SDF-1α为神经新生提供良好的微环境。目的旨在观测梓醇对脑缺血大鼠神经行为学的影响,观测梓醇对脑缺血大鼠神经干细胞增殖迁移分化的作用,并探究其可能的作用机制,为临床应用梓醇治疗脑缺血性疾病提供理论依据。方法1.采用电凝法制备局灶性永久性脑缺血大鼠模型,SD大鼠随机分为假手术组,模型组,造模后1h、24h首次给药组,每组大鼠至少6只。给药组大鼠腹腔注射梓醇5mg/kg,每日一次,连续给药7天,假手术组和模型组注射等量的生理盐水。各组大鼠分别于造模后1,7,14,21d进行神经功能评价,采用神经功能缺损评分（m NSS）和粘滞物移除等行为学方法评价梓醇对脑缺血大鼠神经功能的影响。2.采用BrdU标记体内细胞增殖。（1）研究脑缺血大鼠SVZ区细胞增殖时,分别在造模后7,14,21d取脑组织。各组动物在处死前3天连续给予腹腔注射BrdU（50mg/kg）,1天2次。免疫荧光标记BrdU检测细胞增殖情况。（2）研究脑缺血大鼠SVZ区神经干细胞增殖迁移分化时,各组大鼠在造模后1-7d连续给予腹腔注射BrdU,1天2次,造模后14d取脑组织。免疫荧光双标BrdU/Nestin、BrdU/DCX和BrdU/MAP-2检测神经干细胞增殖迁移分化的情况。3.采用绿色荧光蛋白（GFP）特异性标记SVZ区细胞增殖。造模前5天采用脑立体定位注射方法将携带GFP的逆转录病毒注射到大鼠SVZ区。造模后将大鼠随机分为假手术组,模型组,术后1h和24h首次给药组,给药组大鼠腹腔注射梓醇5mg/kg,每日一次,连续给药7天,假手术组和模型组注射等量的生理盐水。造模后14d取脑组织。通过免疫荧光染色检测GFP、GFP/Nestin、GFP/DCX、GFP/GFAP和GFP/MAP-2蛋白的表达。4.各组大鼠在造模后1-7d连续给予腹腔注射BrdU,1天2次,造模后14d取脑组织。采用CD31免疫荧光染色检测大鼠缺血周围皮质区血管,BrdU/CD31免疫荧光双标显示新生血管表达情况,ELISA检测缺血周围皮质SDF-1α和CXCR4蛋白的表达,Western Blot检测各组大鼠缺血周围皮质区MAP-2、GAP-43、PI3K、p-AKT/AKT和p-ERK/ERK蛋白的表达。5.（1）分离培养24h内新生鼠海马区神经干细胞（NSCs）,进行纯度鉴定。（1）通过CCK8法检测梓醇不同浓度、氧糖剥夺（OGD）不同时间和CXCR4拮抗剂AMD3100不同浓度对NSCs活力的作用。（2）BrdU标记细胞增殖,免疫荧光双标BrdU/Nestin、BrdU/MAP-2检测NSCs增殖,分化情况。（3）ELISA检测NSCs上清液SDF-1α的表达（4）Transwell小室培养NSCs,0.1%结晶紫染色检测NSCs的迁移。（2）分离培养10d左右新生鼠皮质脑微血管内皮细胞（BMECs）,进行纯度鉴定。（1）通过CCK8法检测梓醇不同浓度、氧糖剥夺（OGD）不同时间对BMECs活力的作用。（2）BrdU标记细胞增殖,免疫荧光双标BrdU/CD31检测BMECs增殖情况。（3）ELISA检测不同浓度梓醇对OGD条件下BMECs上清液中SDF-1α蛋白表达的影响（4）Transwell小室结合0.1%结晶紫染色检测BMECs上清液对神经干细胞迁移的影响。结果1.梓醇促进脑缺血大鼠神经功能恢复行为学实验结果:造模后1d,除假手术组以外,各组大鼠m NSS评分和移除粘滞物时间无显著性差异,提示模型制备的均一性与稳定性。造模后7,14d梓醇给药组与模型组比,均显著降低大鼠m NSS评分,同时,减少大鼠移除粘滞物的时间（P＜0.05）。21d时,与模型组相比,1h梓醇给药组显著降低大鼠m NSS评分（P＜0.05）,同时,梓醇显著减少大鼠移除粘滞物的时间（P＜0.01）,提示梓醇给药能够显著促进脑缺血大鼠神经功能的恢复。2.梓醇促进脑缺血大鼠SVZ区神经干细胞增殖、迁移、分化造模后7,14,21d检测了各组大鼠损伤侧SVZ区细胞的增殖,BrdU荧光结果:脑缺血后激活细胞增殖,与模型组相比,梓醇给药后显著促进脑缺血大鼠SVZ区细胞增殖（P＜0.05）,7d时为增殖的高峰期,因此选择造模后1-7d连续注射BrdU研究神经干细胞增殖、迁移和分化,造模后14d取材。免疫荧光双标BrdU/Nestin、BrdU/DCX、BrdU/MAP-2结果提示,梓醇给药组与模型组比均能显著促进神经干细胞的增殖,迁移,分化（P＜0.05）。3.梓醇促进脑缺血大鼠SVZ源性神经干细胞迁移到缺血周围皮质区免疫荧光结果:与假手术组比,脑缺血能够激活SVZ区细胞增殖。与模型组相比,梓醇给药组显著增加大鼠SVZ区GFP+细胞（P＜0.05）,这与BrdU标记体内细胞增殖的结果一致。梓醇给药组大鼠脑缺血周围皮质检测到GFP/DCX,GFP/MAP-2,GFP-GFAP荧光双标细胞,提示梓醇给药促进脑缺血大鼠SVZ区来源的神经干细胞迁移到缺血周围皮质区,并分化为神经元和胶质细胞。4.梓醇介导SDF-1/CXCR4信号通路促进脑缺血大鼠缺血周围皮质神经血管新生免疫荧光结果:与假手术组比,脑缺血损伤显著降低大鼠缺血皮质区域CD31血管密度（P＜0.01）,但增加了BrdU/CD31荧光双标阳性细胞数量（P＞0.05）。与模型组相比,梓醇显著增加大鼠缺血周围皮质BrdU/CD31,CD31阳性细胞数量（P＜0.01）,提示梓醇促进脑缺血大鼠缺血周围皮质血管新生。WB结果:梓醇显著促进缺血周围皮质MAP-2,GAP-43蛋白的表达,提示梓醇能够促进脑缺血大鼠缺血周围皮质神经元新生或存活,有利于轴突生长。结果表明梓醇促进脑缺血大鼠缺血周围皮质神经血管新生,保护神经血管单元。ELISA结果:与假手术组相比,模型组缺血周围皮质区SDF-1α和CXCR4蛋白的表达有增加的趋势,但无明显差异（P＞0.05）。与模型组比较,梓醇显著促进大鼠脑缺血周围皮质SDF-1α和CXCR4蛋白的表达（P＜0.05）。WB结果:与模型组比,梓醇显著上调缺血周围皮质区PI3K,P-AKT,P-ERK蛋白的表达,提示脑缺血后梓醇激活了SDF-1/CXCR4及其下游PI3K/AKT/ERK信号通路。5.梓醇介导SDF-1/CXCR4信号通路促进原代神经干细胞增殖、迁移、分化（1）成功分离培养NSCs,经鉴定后取P3代细胞用于实验。CCK8法筛选出OGD最佳时间为6h,梓醇最佳给药浓度为10μM,AMD3100最佳给药浓度为100μmol/L。为后续实验条件提供依据。（2）免疫荧光结果:与正常对照组比,OGD条件抑制NSCs增殖,抑制其向神经元方向分化,梓醇10μM显著促进NSCs增殖和分化为神经元。与OGD组相比,AMD3100组NSCs增殖细胞,和增殖分化为神经元的比例减少,无明显差异（P＞0.05）,梓醇给药可以明显逆转这种抑制作用（P＜0.01）。Transwell小室结合结晶紫染色结果:与OGD组相比,梓醇给药显著促进NSCs的迁移,AMD3100给药显著抑制NSCs的迁移（P＜0.01）,梓醇给药可以显著逆转AMD3100对NSCs迁移的抑制作用（P＜0.01）。6.梓醇介导SDF-1α旁分泌信号促进原代神经干细胞迁移（1）成功分离培养BMECs,经鉴定后取P3-P5代细胞用于实验。CCK8法筛选出OGD最佳时间为4h,梓醇给药浓度为2、10、50μM,为后续实验条件提供依据。（2）免疫荧光结果:OGD条件下BMECs细胞增殖受到抑制,梓醇2、10、50μM呈剂量依赖促进BMECs增殖。ELISA结果:梓醇50μM显著促进BMECs上清中SDF-1α蛋白的表达。BMECs上清液与NSCs共培养结果:BMECs上清液与NSCs共培养后,促进NSCs的迁移,经梓醇干预后的BMECs上清液进一步促进NSCs迁移,而梓醇的这种有益作用可以被AMD3100部分阻断。提示梓醇促进内皮细胞增殖,分泌SDF-1α可为神经新生迁移提供较好的微环境可能。结论1.梓醇促进局灶性永久性脑缺血大鼠神经功能的恢复。2.梓醇促进脑缺血大鼠损伤侧SVZ区神经干细胞增殖迁移分化,促进脑缺血周围皮质血管新生,关键靶点可能是SDF-1α/CXCR4及其下游PI3K/AKT/ERK信号通路。3.梓醇介导SDF-1/CXCR4信号通路促进原代神经干细胞增殖迁移分化。