鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis,以下简称鼠疫菌)引起的一种暴发性的烈性传染病。人类跟鼠疫之间存在一个长期的斗争过程,到目前为止,鼠疫仍然是公共卫生领域的一个重大的威胁,每年国际上都会出现疫情暴发并致人死亡。传统的微生物学、基因组学以及细菌群体遗传学都表明鼠疫菌是在约2600-5000年前由假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis,简称假结核菌)进化而来。由于遗传分化时间非常短暂,鼠疫菌跟其祖先菌株假结核菌同时存在,我们能够通过比较基因组学和功能基因组学实验的方式来研究鼠疫菌这种致命的病原菌是如何进化而来的。假结核菌是一种肠道病原菌,其可以在土壤环境或者水环境等自然环境中长时间生存,仅会引起慢性肠道疾病。与假结核菌不同,鼠疫菌具有更强的侵袭能力和致病能力,但其通常只能在哺乳动物和跳蚤之间的狭小宿主范围内传递。鼠疫菌和假结核菌在传播途径、致病能力和生存环境上存在着巨大的差异,而二者90%以上的基因都是相同或者几乎相同的。鼠疫菌和假结核菌的基因组比较结果显示,鼠疫菌获得了两个外源性的质粒(p MT1和p PCP1),同时约有13%的假结核菌基因在鼠疫菌中失去了活性。在这些失活基因中,编码天门冬氨酸酶的asp A基因是很独特的。天门冬氨酸酶(Asp A)催化一个可逆反应(天门冬氨酸生成延胡索酸并释放一个氨基)。我们前期对于鼠疫菌基因组的研究发现,asp A基因第363位密码子是鼠疫菌进化中的一个突变热点。为了进一步检验asp A基因第363位密码子的多样性,我们对来自我国14个不同疫源地不同分离时间(1943年至2005年期间)的819株鼠疫菌进行了asp A基因测序,确定了asp A基因第363位密码子至少9种等位基因型的存在。进一步的信息学分析显示这些突变并不是进化谱系(lineage)特异性的,而且同一种突变在鼠疫菌的进化过程中多次出现。鼠疫菌asp A基因第363位密码子的高突变频率以及这些等位基因型的趋同进化表明,该密码子的突变可能是经过多样化的正向选择压力筛选形成的。在典型鼠疫菌群体中,asp A基因第363位密码子的主要等位基因型是TTG,其编码的天门冬氨酸酶功能失活。但是在假结核菌和一些古老的鼠疫菌中,asp A基因第363位密码子是GTG,其编码了一个功能正常的天门冬氨酸酶。根据上述的结果我们提出假设,asp A基因第363位密码子的高频率突变是趋向于恢复鼠疫菌中天门冬氨酸酶的活性。为了验证这一推论,我们需要在鼠疫菌asp A基因的第363位密码子处引入不同的突变并通过实验验证这些突变对鼠疫菌生存和繁殖带来的影响。鼠疫菌201菌株根据鼠疫菌的生物型分类,属于田鼠型菌株,其asp A基因第363位密码子为GTG,与假结核菌中的asp A基因一致,其编码的天门冬氨酸酶是有活性的。我们基于λ-Red重组系统在鼠疫菌中建立了一个无痕突变技术平台,并成功构建了两株鼠疫菌201菌株asp A基因第363位密码子突变株,其中一株将asp A基因第363位密码子由GTG突变为TTG(201-asp ATTG),导致了其编码天门冬氨酸酶的失活;另一株将密码子由GTG突变为TTT(201-asp ATTT),其编码天门冬氨酸酶活性降低至野生型10%左右。随后我们比较了鼠疫菌201野生株和突变株之间的表型差异。经过实验我们发现,asp A基因第363位密码子的突变对201株的生长和抵抗外界环境胁迫能力造成了明显的影响。与201野生株和突变株201-asp ATTT相比,突变株201-asp ATTG在丰富培养基(LB培养基)或者营养缺乏培养基(TMH培养基)中的生长均存在一定程度的迟滞。当去除掉TMH培养基中的L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺等Asp A代谢相关的氨基酸后,201菌株野生株和突变株201-asp ATTT以及201-asp ATTG的生长状态趋于一致,证明这种生长差距确实是由asp A基因的突变引起的。进一步的抗外界环境胁迫能力实验显示,201野生株和突变株201-asp ATTT的抗氧化能力和耐酸能力均要优于突变株201-asp ATTG。这些体外模拟刺激条件都与巨噬细胞内的微环境吻合,提示我们asp A基因的多样性可能与鼠疫菌在巨噬细胞内的存活和增殖能力相关联。进一步的实验结果证实了这个猜想:与201菌株野生株相比,突变株201-asp ATTT和201-asp ATTG的抗吞噬能力没有差异,但是二者在RAW264.7巨噬细胞中的生存和增殖能力均出现了缺陷。而鼠疫菌在巨噬细胞内的存活和增殖能力,对于鼠疫菌早期感染是至关重要的。为了比较201野生株和两株突变株之间的毒力差异,我们用BALB/c小鼠进行了腹股沟皮下注射攻毒,绘制了小鼠生存曲线,并测量了突变株对小鼠的半数致死量(LD50)。结果显示,突变株201-asp ATTT和201-asp ATTG均出现了不同程度的减毒,突变株201-asp ATTT对BALB/c小鼠的半数致死量为5.75×105CFU,突变株201-asp ATTG的减毒程度更高,3.69×106CFU的攻毒剂量都无法造成小鼠的死亡,而201野生株对BALB/c小鼠的半数致死量小于10CFU。这一系列毒力实验结果提示我们,asp A基因第363位密码子的突变与鼠疫菌的毒力有着密切的关系。最后我们进行了一个体外培养竞争实验,将201菌株野生株和突变株201-asp ATTG按照一定的比例混合后,在丰富培养基(LB)中共培养,随后提取混合DNA并对Asp A基因进行扩增测序。通过高通量测序分析,我们发现201菌株野生株(Asp A有活性)能够在生长的过程中很快的超越突变株201-asp ATTG(Asp A失活),在群体中占据优势地位。这一结果说明在鼠疫菌中,含有asp A活性基因的菌株具有适应度优势,asp A基因第363位密码子承受了正选择压力而趋于恢复典型鼠疫菌中失活asp A基因的活性。我们的实验结果表明,细菌中特定基因的单一密码子也可以成为自然选择的作用对象。