研究背景机体的免疫系统具有控制肿瘤发生发展的能力,是肿瘤研究中最古老的概念之一。其中肿瘤微环境的免疫状态在肿瘤发生学及治疗方面又具有至关重要的作用。随着科学技术和方法学的进步,越来越多的肿瘤抗原被鉴定出来。研究者发现,虽然很多肿瘤抗原的免疫原性不弱,而且抗原提呈细胞可迅速呈递大多数肿瘤抗原,肿瘤患者体内也确实存在针对肿瘤抗原所产生的免疫应答,但相关免疫应答产物并不能产生有效的抗肿瘤效应。当前多数免疫治疗方法均能够增强患者全身的免疫功能,但抗瘤效果却与预期的相差很多。原因主要在于肿瘤患者免疫功能状态并不能直接反应机体的抗肿瘤免疫效应,即使患者全身免疫功能得到改善,肿瘤微环境内的免疫效应却仍处于抑制状态。肿瘤微环境是肿瘤细胞发生发展过程中所处的内环境,由肿瘤细胞本身、间质细胞、微血管、组织液及少量浸润细胞,如树突状细胞、巨噬细胞等共同组成。作为肿瘤免疫效应阶段的执行场所,肿瘤微环境内存在多种因素均与局部免疫抑制状态的产生有关,并形成了肿瘤局部微环境中特有免疫模式。肿瘤细胞不仅逃避免疫系统的攻击,同时也抑制其生长环境中的免疫细胞的正常功能。这些因素为开辟新的肿瘤免疫治疗方案提供了思路。随着分子生物医学的发展,免疫治疗作为肿瘤第四种治疗模式-生物治疗的重要组成部分,在肿瘤治疗中的地位和作用日趋重要。逆转肿瘤微环境的免疫抑制状态是当前肿瘤免疫治疗的难题与突破点。研究目的应用健康成人B型血全血腹腔注射免疫BALB/c小鼠使其体内产生抗血型抗原B抗体；构建BALB/c小鼠4T1乳腺癌荷瘤模型；在BALB/c小鼠荷瘤模型中瘤内注射血型B抗原模拟多肽/Fas重组腺病毒,测定其在肿瘤组织中的表达情况,观察其对人红细胞悬液免疫后的小鼠肿瘤生长的抑制作用及对生存期的影响；测定瘤内注射重组病毒后小鼠肿瘤微环境淋巴细胞、TNF-α、IFN-γ、IL-2、微血管密度等免疫功能指标,判定其对肿瘤微环境免疫抑制状态的逆转作用。实验方法1将健康成人全血稀释成不同浓度红细胞悬液,腹腔注射免疫BALB/c小鼠,每次0.2ml,2次／周,免疫后3天、7天、14天、21天、28天,分别测定小鼠体内产生抗血型抗原B抗体效价,择优选择最适宜的红细胞悬液免疫浓度,分析抗体产生的趋势,为后续试验做准备；2无菌环境下培养4T1乳腺癌细胞,至对数生长期,制备细胞悬液(浓度为106/m1),小鼠乳腺脂肪垫区皮下注射上述浓度4T1乳腺癌细胞0.2ml。7天左右,肿瘤长至1cm左右大小,选取肿瘤无出血坏死的小鼠进一步实验；3选取肿瘤大小相近、肿瘤无出血坏死的18只荷瘤小鼠,随机分3组,分别瘤内注射重组腺病毒Ad-P1/Fas(效价为7×1010pfu/mL)、空腺病毒(效价为2.21×1011pfu/mL)、0.9%NaCL0.1ml,连续注射3天。注射后第10天处死三组小鼠,取出肿瘤组织,应用western blot方法测定B/Fas在肿瘤组织中的表达情况。流式细胞仪检查肿瘤内淋巴细胞的变化、ELISA法测定TNF-α、IFN-γ、IL-2含量、免疫组织化学法检测CD34表达,并判定其对肿瘤微环境免疫抑制状态的逆转作用；436只荷瘤小鼠,分三组,每组12只,每组随机取5只小鼠应用游标卡尺测量三组小鼠肿瘤长径a和垂直宽径b,比较注射前、注射后3天、7天、14天三组小鼠肿瘤体积变化,并观察所有荷瘤小鼠的生存期,设定观察期限为60天。肿瘤体积计算方法如下：V(cm3)=1/2axb2。观察不同处理对小鼠肿瘤生长的抑制作用及对生存期的影响。5统计方法(1)计量资料结果以均数±标准差表示；(2)不同分组不同时间抗血型抗原B抗体效价、目的蛋白B/Fas的表达量灰度值、肿瘤体积比较应用SPSS13.0统计软件包采用重复测量数据的方差分析比较,不同时间点各处理组间抗血型抗原B抗体效价、目的蛋白B/Fas的表达量灰度值、肿瘤体积、肿瘤内淋巴细胞亚群、细胞因子的测定、肿瘤内微血管密度比较应用SPSS13.0统计软件包采用one-way ANOVA方法分析及组间比较采用LSD法,如方差不齐则选择近似F检验Welch法,及Dunnett’s T3组间比较。以P<0.05为差异有显著性。(3)各组小鼠生存期间应用Kaplan-Meier法进行统计学检验。组间比较采用Log rank法。以P<0.05为差异有显著性。实验结果1成功应用健康成人B型红细胞悬液诱导小鼠产生抗血型B抗原抗体,不同浓度红细胞悬液之间的免疫作用无统计学差异(F=1.871,P=0.196),免疫后14天、21天抗体效价值达最高。2瘤内注射B/Fas重组腺病毒后3天、注射后7天、注射后10天、注射后14天,目的蛋白B/Fas均可在肿瘤组织中稳定表达,且不同时间点表达量有显著差异(F=36.322,P<0.001),以瘤内注射后7-10天左右表达量最高。3分别应用瘤内注射B/Fas重组腺病毒、空腺病毒、生理盐水处理经红细胞悬液免疫的小鼠,不同组间肿瘤体积变化比较具有显著差异(F=18.16,P<0.001)。注射前、注射后3天、7天、14天不同时间点小鼠肿瘤体积变化比较具有显著差异(F=129.291,P<0.001)。4瘤内注射B/Fas重组腺病毒、空腺病毒、生理盐水后三组荷瘤小鼠的生存期无显著性差异(P=0.154)。5小鼠肿瘤组织病理切片示人红细胞悬液免疫后瘤内注射血型B抗原模拟多肽/Fas重组腺病毒10天后可使肿瘤细胞坏死及炎症细胞的浸润明显增加,对照组效果欠佳。6瘤内注射血型B抗原模拟多肽/Fas重组腺病毒、瘤内注射空腺病毒、瘤内注射生理盐水处理后10天,小鼠肿瘤组织内CD3+淋巴细胞、CD4+淋巴细胞、CD8+淋巴细胞、CD4+CD25+淋巴细胞的比例在不同组间的比较有显著性差异(F=104.835,P<0.001；F=150.153,P<0.001；F=48.494,P<0.001；F=65.823,P<0.001)。瘤内注射血型B抗原模拟多肽／Fas重组腺病毒可明显增加小鼠肿瘤组织内CD3+淋巴细胞、CD4+淋巴细胞、CD8+淋巴细胞亚群的比例,并减少CD4+CD25+淋巴细胞的比例。7瘤内注射血型B抗原模拟多肽/Fas重组腺病毒、空腺病毒、生理盐水不同处理后10天,不同组间肿瘤内TNF-α、IFN-γ、IL-2变化的比较均有统计学意义(F=16.418,P<0.001;F=94.032,P<0.001;F=69.848,P<0.001)。不同组间多重比较示,瘤内注射B/Fas重组腺病毒可较对照组明显增加肿瘤组织内TNF-α、IFN-γ、IL-2含量,增强局部抗肿瘤效应。8瘤内注射血型B抗原模拟多肽/Fas重组腺病毒、空腺病毒、生理盐水不同处理后10天,瘤内注射B/Fas重组腺病毒与瘤内注射空腺病毒或生理盐水组间微血管数量的比较均有显著性差异(P=0.001,P=0.003),而瘤内注射空腺病毒与瘤内注射生理盐水组比较则差异无统计学意义(P=0.724)。瘤内注射重组腺病毒较对照组可明显减少肿瘤内微血管的数量。结论重组腺病毒载体感染后,B/Fas融合蛋白在小鼠肿瘤组织中高效表达；经健康成人B型血红细胞悬液腹腔注射免疫后小鼠体内可产生有效的抗血型B抗原抗体；红细胞悬液免疫后的BALB/c小鼠经瘤内注射B/Fas重组腺病毒处理可明显抑制4T1乳腺癌的生长,与其他组的生存期比较无区别。与对照组比较,瘤内注射血型B抗原模拟多肽/Fas重组腺病毒可明显增加肿瘤组织内效应淋巴细胞的比例,CD3+、CD4+、CD8+淋巴细胞亚群的比例增加,并减少肿瘤浸润性淋巴细胞CD4+CD25+淋巴细胞亚群的比例,有利于逆转肿瘤微环境抑制状态；瘤内注射B/Fas重组腺病毒可较对照组明显增加肿瘤组织内TNF-α、IFN-γ、IL-2含量,增强局部抗肿瘤效应；瘤内注射重组腺病毒可较对照组明显减少肿瘤内微血管的数量,从而有效抑制肿瘤的生长。