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由于化石能源价格的不断上涨以及化石能源燃烧所造成的一系列环境问题,藻类作为一种潜在的生物能源的制造者已经得到了广泛的关注。这就需要大规模的培养高浓度的产油微藻,但是对于大规模培养过程中可能影响藻类的生长及稳定性的重要因素——藻际细菌的多样性及功能至今还很少研究。细菌群落结构的变化往往会影响藻类的生长及生理的变化。
在本研究中,首先尝试使用二叠纪地下水(Permian ground water)培养1株具有产油潜力的微拟球藻Nannochloropsis oceanica IMET1；同时应用可培养手段和两种不依赖培养的分子生物学手段——变性梯度凝胶电泳(DGGE)和基于16S rRNA基因的克隆文库,研究在三个不同温度培养条件下藻际细菌群落结构的变化。在此过程中分离到1株具有絮凝沉降藻细胞功能的细菌并对其进行了鉴定,同时也对其絮凝沉降藻细胞的机理进行了初步分析。此外还通过脉冲场凝胶电泳技术研究了产油藻微拟球藻N.oceanica IMET1的基因组大小及染色体组成。主要实验结果如下:
1、为了避免在产油藻培养过程中的“与人争水”的现象,利用采自美国德克萨斯州因佩里亚尔的佩科斯河新生代海槽的二叠纪地下水,研究产油微拟球藻 N.oceanica IMET1是否能够在二叠纪地下水中生长。产油微拟球藻N.oceanica IMET1在补充少量氮源和磷源的二叠纪地下水中能够很好的生长,其脂含量也相对理想。在整个15 d的培养周期中,三个温度下藻培养物的干重稳定增长。微拟球藻N.oceanica IMET1在25℃培养温度下的表现出最好的生长效率,15 d时藻培养液的干重是初始接种时的8倍。由于添加足够的氮源和磷源,微拟球藻N.oceanica IMET1的脂含量在初始3 d内三个培养温度下均降低,从40％降低到20％左右。
2、培养9 d后,30℃培养条件下的微拟球藻N.oceanica IMET1培养液开始聚集沉淀,而在15℃和25℃藻细胞在培养液中仍保持均一。随着藻絮凝沉降现象的出现,30℃细菌群落结构也发生了明显的变化。基于DGGE的分析表明,一些高G+C含量的细菌仅在30℃培养条件下出现,这与可培养细菌的数据一致。基于16S rRNA基因的克隆文库分析也证实了30℃培养条件下细菌群落结构的显著变化,而且有些细菌的序列只能在这个温度下被检测到。
3、利用可培养的手段,我们从产油微拟球藻N.oceanica IMET1的藻培养物中分离纯化到1株新菌,命名为HW001。这株新菌表现出明显的絮凝沉降微拟球藻N.oceanicaIMET1的能力,藻和细菌共培养3 d后大多数藻细胞被絮凝沉降,而藻细胞的脂含量却没有受到很大的影响。对HW001絮凝沉降产油微拟球藻N.oceanica IMETl的机理的初步研究表明,HW001和微拟球藻N.oceanica的接触对于絮凝沉降来说是必须的。另外,HW001不仅能够絮凝沉降微拟球藻N.oceanica IMET1,还能够絮凝沉降应用于本研究的微拟球藻N.oceanica CT-1,生物扁藻Tetraselmis suecica和T.chuii等3株真核微藻和1株蓝细菌聚球藻Synechococcus WH8007。
4、16S rRNA基因序列对比表明,HW001具有很高的特异性,它与所有已可培养的细菌中最相似的菌株的序列相似度只有89％。其相似度最高的可培养菌株假单胞菌Pseuodomonas sp.BRAZ6-1属于γ-变形杆菌纲,假单胞菌目的假单胞菌科。对HW001与假单胞菌目中所有的模式菌株以及菌株假单胞菌Pseuodomonas sp.BRAZ6-1的进化分析表明,菌株HW001属于假单胞菌目,但不归属于该目中两个科(假单胞菌科和莫拉菌科)的任何一科。针对菌株HW001的16S rRNA基因设计的特异性引物以及相关扩增表明菌株HW001起源于二叠纪地下水。
5、借助脉冲场凝胶电泳技术,研究了微拟球藻N.oceanica IMET1的基因组组成和大小。在两块脉冲场凝胶电泳凝胶上共识别出22条大小从600到3700 kb的条带,这表明产油微拟球藻N.oceanica IMET1的基因组由22条染色体组成,根据PFGE结果进行估算,推测产油微拟球藻N.oceanica IMET1的基因组大小约为31,556 kb,与全基因组测序的结果基本吻合。