研究背景卵巢功能早衰(Premature ovarian Failure, POF)是多种病因所致的卵巢功能衰竭,发生于青春发育后至40岁以前的妇女,以闭经为主要临床表现,并伴有血清雌二醇水平下降和促性腺激素水平上升。卵巢早衰在临床上可出现因雌激素低落而发生的潮热、出汗、情绪不稳定、疲乏、记忆力下降等神经精神症状以及闭经、外阴干燥、疼痛、尿频、尿急等生殖泌尿道萎缩刺激症状和其他相应的临床症状。因缺少雌激素的保护,有患者可能会出现心脑血管疾病和骨质疏松等伴发疾病。且大多数POF患者要受到不孕症的困扰。特别是对有生育要求的POF患者,这将给她们带来精神和身体上的极大痛苦。实验室检查可以发现POF患者血中FSH和LH持续在40IU／L以上,FSH升高更明显,雌二醇(E2)常低于50-70pmol／L。经阴道超声检查可见POF患者子宫、卵巢小于生育期妇女,卵巢内无卵泡存在或虽有卵泡存在、但数目很少,卵泡直径很少在10mm以上,连续监测无卵泡发育及成熟。POF的病因复杂,目前认为POF的发病与自身免疫功能异常、染色体异常、遗传因素、代谢异常、医源性及感染性因素等有关。近年来,恶性肿瘤的发病率呈持续升高,因化疗而导致卵巢功能低下和不孕的患者日渐增多,成为POF发病的一个重要原因,化疗药物具有明确的卵巢毒性,主要通过诱导卵母细胞和颗粒细胞发生凋亡,使卵泡闭锁,发生POF。现阶段POF的治疗常仅以雌孕激素替代治疗和辅助生育技术为主,可以暂时缓解患者的更年期症状,但这些治疗方法并不能从根本上治疗POF,且常年应用还可能带来严重的副作用。随着恶性肿瘤患者年轻化及化疗后患者存活率的提高,寻找新的治疗途径已成为妇产科医务人员的迫切任务。Foxo3a是叉头转录因子家族“O”组成员之一,近年研究发现,Foxo3a基因是一个调节及抑制卵巢中卵泡活化的关键基因。其主要通过PI3K途径起作用,Akt被激活后,Foxo3a出核而失去转录活性。Foxo3a功能完全缺乏会导致大量始基卵泡的活化,随之开始出现性成熟,进一步会使卵泡过早的耗竭,导致卵巢早衰和不孕症的发生。Foxo3a也能增强周期抑蛋白的表达使细胞周期停止于G0／G1期。女性的生育期限由出生时原始卵泡池的大小和储备量以及出生后卵泡闭锁的速率所决定。卵巢早衰的妇女,无论是遗传因素还是医源性因素,根本原因为始基卵泡的过度耗竭,因此,如果能上调Foxo3a基因,不仅能抑制卵泡活化,保存生育功能,还能使细胞停在相对静止的细胞间期,降低化疗药对其的损害作用。近年来,分子生物学领域取得了迅猛发展,基因治疗作为一种新的医疗手段,为人类疾病治疗开辟了一条新的途径。如何安全地转移治疗基因,使其在宿主细胞中高效表达是基因治疗的关键。在众多的病毒载体中,腺病毒倍受关注,因有以下五大优点,使其在临床上得到广泛应用。①既可以感染分裂期细胞,又可以感染非分裂期细胞；②外源基因表达水平高；③病毒滴度高,制备纯化相对容易；④插入外源基因容量大；⑤病毒基因组较少发生重排。其中应用最多的是人5型腺病毒(Ad5)。骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是存在于骨髓微环境中的一种成体干细胞,具有不可忽视的优点,具有多向分化潜能,取材方便,能在体外大量扩增,可行自体移植,避免了免疫排斥反应及伦理道德等问题,因而具有广阔的应用前景。本课题拟通过分子生物学相关技术,利用改进的携带绿色荧光蛋白的AdEasy-1腺病毒载体系统,构建携带大鼠Foxo3a基因的重组腺病毒,包装、扩增、纯化后,体外感染大鼠骨髓间充质干细胞,为进一步探讨利用Foxo3a进行卵巢早衰的基因治疗提供了相关实验基础。目的为深入研究Foxo3a基因治疗化疗性卵巢早衰的可行性与有效性,我们拟应用AdEasy-1腺病毒系统构建包含大鼠Foxo3a基因的缺陷型腺病毒质粒,利用相应的包装细胞系,制备具有感染能力的腺病毒颗粒,并感染有多分化潜能的骨髓间充质干细胞,为进一步研究Foxo3a基因在化疗性卵巢早衰动物模型上的治疗作用打下基础。方法1.提取大鼠脾脏总RNA,运用重叠延伸聚合酶链反应(Overlap-PCR)方法,设计特定限制性酶切位点,合成大鼠Foxo3a基因编码区全长序列,亚克隆至pMD19-T载体中,用碱裂解法提取质粒,对含目的片段的阳性重组克隆进行全序列测定。测序结果均通过互联网用Advanced BLAST2.0软件与GenebBank中的大鼠Foxo3a-cDNA序列进行同源性分析。2.将测序正确的阳性重组质粒大量扩增并纯化,经XbaI及KpnI两种特异性酶切后定向克隆到携带绿色荧光蛋白(green fluorecence protein, GFP)的AdEasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV中,构建重组穿梭质粒pAdTrack-fox。PmeⅠ酶切pAdTrack-fox后转化至含有骨架质粒p AdEasy-1的BJ5183感受态细菌中进行同源重组,获得重组腺病毒质粒。3.将重组腺病毒质粒线性化后,通过Lipofectamine2000转染HEK293细胞,得到包含大鼠Foxo3a基因的完整腺病毒颗粒Ad-fox,通过氯化铯密度梯度离心法加以纯化后,用半数组织培养感染剂量法(TCID50法)测定其病毒滴度。提取病毒液的总RNA,运用RT-PCR方法检测病毒中Foxo3a基因mRNA的转录。4.将携带Foxo3a基因的腺病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞,RT-PCR法检测Foxo3a的mRNA表达情况,台盼兰检测感染后细胞活力,运用MTT方法检测Ad-fox感染后的MSCs细胞增殖情况,并绘制生长曲线。结果1.从大鼠脾脏组织中提取的总RNA,琼脂糖凝胶电泳,可见3条清晰的RNA带(28S、18S与5S),反转录后获得cDNA,经PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳,可见约2019bpDNA条带,与预期的结果相符。重组阳性克隆酶切后电泳得到2019bp和2700bp条带,提取质粒进行测序。测序结果进行同源性分析,同源性为99.9%。证实成功得到编码大鼠Foxo3a蛋白的基因片段。2.将大鼠Foxo3a基因插入重组病毒载体中。经特异性酶切反应鉴定,证实重组腺病毒质粒pAdEasy-fox构建成功。构建的重组质粒经测序验证,所获得目的基因序列与已发表的大鼠Foxo3a基因序列相比,有两个碱基发生突变,但其编码的蛋白序列与GenBank中大鼠Foxo3a蛋白质序列完全一致,属于沉默突变型,不影响后续表达。3.重组腺病毒质粒pAdEasy-fox大量扩增纯化后,在体外利用脂质体2000成功转染病毒包装细胞HEK293,最早在转染后24小时,在荧光显微镜下可见GFP的表达；约在转染后14天,大部分HEK293细胞胞体固缩、悬浮,收集细胞裂解液进行PCR鉴定,得到预期2019bp大小的Foxo3a基因条带,证实重组腺病毒Ad-fox已包装成功。利用半数组织培养感染剂量法(TCID50)测得,扩增纯化后获得的重组腺病毒Ad-fox滴度(Titer)为1.2×10-10pfu／ml。4.采用不同MOI的病毒液感染大鼠骨髓间充质干细胞,感染后培养48h在荧光显微镜下观察其感染效率,结果可见：当MOI为10时,仅有10%左右的细胞有荧光表达；当MOI为100时,约有90%以上的细胞GFP表达阳性,且细胞形态与未感染细胞相同。用RT-PCR法检测到被感染的大鼠骨髓间充质干细胞Foxo3a mRNA的表达,MTT法测得最佳MOI感染细胞与对照组细胞的生长曲线无明显差异。结论1.本实验成功克隆了大鼠Foxo3a基因,为进一步研究Foxo3a cDNA的基因功能及进行基因治疗奠定了基础。2.成功构建了携带大鼠Foxo3a基因融合绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒载体,并包装出高滴度、高纯度的腺病毒。3.携带Foxo3a基因的重组腺病毒载体感染大鼠骨髓间充质干细胞后,Foxo3a基因有效进行了转录,在MOI值为100时感染效率达90%,细胞具有最佳的生长状态,且细胞活力及细胞增殖曲线无明显改变。本研究为进一步探讨利用Foxo3a进行卵巢早衰的基因治疗提供了相关实验基础。