胃蛋白酶(pepsin)属于天冬氨酸蛋白水解酶,是胃消化蛋白水解酶类,其前体物质是胃蛋白酶原。胃蛋白酶原合成于脊椎动物的胃基底部粘膜,在胃液的酸性条件下转化成胃蛋白酶。目前,国内外市场上的胃蛋白酶主要提取于猪胃粘膜,猪胃蛋白酶(EC 3.4.23.1)的分子量为31～36 ku。我国对猪胃蛋白酶的提取方法主要是应用传统的酸法提取配合有机溶剂分离,粗酶液再经乙醚脱脂、浓缩干燥,得到的产品酶活力仅为1948.5 U/g,而且此法生产周期长,生产技术参数不宜把握,得到的猪胃蛋白酶活力低且不稳定。国外对猪胃蛋白酶的提取是将酸法制备的粗提液通过有机溶剂和盐析沉淀,最终得到了商业结晶胃蛋白酶。但此工艺耗时较长,提取率也相对较低。为此,本课题在前人研究的基础上,进一步探寻高效、先进的提取分离纯化技术,以便能够充分的利用猪胃资源,提高猪胃产品的附加值。(1)猪胃蛋白酶提取方法的比较分析及最佳技术参数的确定。本实验以猪胃粘膜为原料,对先进的超声辅助酸提法与常规的酸法、碱法提取猪胃蛋白酶效果进行了比较分析,结果表明:超声辅助酸提法较传统碱法浸提时间缩短近15倍,比活力提高36.4%,较酸法浸提时间缩短1.5h,比活力提高近70%;继续以猪胃蛋白酶比活力为指标,对影响超声辅助提取猪胃蛋白酶的条件进行优化,得出其最佳提取条件为:超声功率220±20 W、超声频率28 KHZ、料液比1:3.5、添加吐温-80 11 mg/mL、超声处理时间为111 s,得到猪胃蛋白酶粗酶液的比活力为5.82±0.02 U/mg。(2)猪胃蛋白酶分离纯化技术研究。以超声波处理得到的粗提液为原料,通过乙醇辅助盐析对照实验及影响离心、超滤工艺的双因素交叉实验,确定出猪胃蛋白酶最佳分离纯化条件为:粗酶液中无水乙醇的添加量为1%,硫酸铵分级盐析浓度为20%～40%,12 000 rpm,15 min离心,超滤时料液比为1:8、压力为0.03 MPa。此工艺条件下冷冻干燥得到猪胃蛋白酶粉的活力为102 927.5±9.8 U/g,该酶经Sephadex-G 75洗脱得到单一蛋白峰,再经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,表现为单一蛋白带,酶的相对分子质量约为35 ku。(3)所得猪胃蛋白酶的性质及稳定性分析。为进一步确定新工艺方法制备的猪胃蛋白酶的性质,分别对所得猪胃蛋白酶粉最适pH和不同pH条件下的稳定性、最适温度和热稳定性、最适酪蛋白底物浓度进行测定,并将其与酸法生产的猪胃蛋白酶在不同浓度氯化钠溶液及储藏过程中的稳定性进行监测对照。实验结果表明:新工艺方法制备的蛋白酶为猪胃蛋白酶,其最适pH 1.8、最适温度40℃、最适酪蛋白底物浓度2%,在0.5 mol/L的氯化钠溶液中作用30 min,活力保持在99%以上,﹣20℃保存40 d后活力保留率达到98%以上,90 d后仍能保留85%以上,而传统酸法生产的猪胃蛋白酶储藏90 d后仅为初始酶活的52%。