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目的:据我国2018年癌症统计数据显示,结直肠癌（colorectal cancer,CRC）发病率、死亡率在全部恶性肿瘤中分别位居第3位和第5位,其中新发病例37.6万,死亡病例19.1万。近年来,我国结直肠癌的发病率和死亡率均呈现上升趋势,已成为严重危害我国居民健康的恶性肿瘤之一。值得注意的是,我国直肠癌发病率占全部结直肠癌的30～60%,显著高于西方国家。目前,局部晚期直肠癌的标准治疗方案为直肠癌术前新辅助放化疗（neoadjuvant chemoradiation therapy,n CRT）。然而,不同的直肠癌患者放疗的敏感性具有显著差异,总体病理完全缓解（Pathological complete remission,PCR）率仅为20%左右。因此,早期预测患者放疗敏感性以及寻找增强患者放射治疗敏感性的新靶点和新策略具有重要的临床意义。极光激酶A（Aurora kinase A,AURKA）又称BTAK（breast tumor activated kinase）或STK15（serine threonine kinase 15）于1995年由Glover博士在研究黑腹果蝇纺锤体组织缺陷相关等位基因突变的过程中首次发现,属于Ser/Thr蛋白激酶家族。AURKA主要调控中心体和微管的功能,在细胞有丝分裂过程中扮演重要角色。同时,AURKA通过介导多种信号传导通路,如:MDM2/p53信号通路;PI3K/AKT信号通路;NF-κB信号通路;JAK2/STAT3信号通路;ATM/CHK2/p53（DNA损伤修复反应途径）通路;BRCA1/2信号通路等。进而调控多种细胞生物学行为,包括细胞周期,细胞凋亡和细胞衰老等。目前,直肠癌患者肿瘤组织中AURKA表达水平与患者放疗敏感性及不良预后之间的关系未有报道,AURKA对直肠癌放射治疗敏感性的影响尚不清楚。因此,在本研究中我们将探讨直肠癌患者肿瘤组织极光激酶A表达水平与直肠癌患者放射敏感性及不良预后之间的关系;明确极光激酶A在结直肠癌细胞恶性表型,包括细胞增殖、迁移与侵袭、细胞周期、细胞凋亡以及结直肠癌细胞对电离辐射敏感性的影响,并深入阐明极光激酶A通过靶向调控c-Myc/CDK1/cyclin B1信号通路参与结直肠癌细胞对电离辐射的敏感性,为AURKA作为放疗增敏的潜在分子靶点及作为预测直肠癌放疗预后指标提供实验基础与临床依据。研究方法:1、收集自2013年3月至2018年6月在辽宁省肿瘤医院接受术前新辅助放化疗的直肠癌患者130例,所有患者均术前经电子肠镜检查取得明确病理学诊断。采用免疫组化（IHC）方法检测AURKA在局部晚期直肠癌患者组织中的表达水平,进而分析AURKA表达水平与临床病理因素及放射治疗预后的相关性。2、采用Western blot方法检测结直肠癌细胞HCT116、HT-29、SW480、Lo Vo,COLO205和RKO细胞中AURKA蛋白的表达水平。通过慢病毒包装的AURKA-shRNA感染HCT116和HT-29细胞,加入嘌呤霉素进行筛选并采用RT-PCR和Western blot分别检测AURKA m RNA和蛋白质的表达水平,筛选出AURKA稳定敲减的HT-29-shR-A和HCT116-shR-A细胞株。CCK8法评估下调AURKA对结肠癌细胞HCT116和HT-29细胞增殖能力的影响。采用克隆形成实验考察下调ARUKA对结肠癌细胞放射敏感性的影响。采用细胞划痕愈合实验、Transwell迁移及侵袭实验评价下调AURKA对结肠癌细胞HCT116和HT-29迁移和侵袭能力的影响。采用Annexin V-PE/7AAD双染流式细胞仪检测下调AURKA对细胞凋亡的影响。采用PI单染流式细胞仪检测AURKA对细胞周期的影响。采用脂质体瞬时转染质粒载体上调结肠癌细胞中c-myc的表达。采用Western blot法检测AURKA下游相关信号通路节点蛋白表达变化。3、统计分析采用SPSS21.0统计学软件进行数据分析。使用χ2检验比较计数资料,使用Kaplan-Meier法估算生存率,log-rank法进行单因素分析,COX回归模型进行多因素分析。实验结果以平均数±标准差（mean±SD）的形式表示,两组之间比较采用t检验或单因素方差分析（One-way ANOVA）,p<0.05具有统计学差异。统计图表由Graphpad prism8版本软件绘制。结果:1、极光激酶A表达水平与直肠癌患者放射敏感性及不良预后之间的相关因素分析在130例接受术前同步放化疗的局部晚期直肠癌患者肠镜组织标本中极光激酶A高表达64.62%（84/130）,低表达为35.38%（46/130）。与患者临床病理因素及的相关性分析中发现极光激酶A表达水平与直肠癌位置（肿瘤距肛门≦5cm或>5cm）（p<0.0108）和复发转移（p<0.0358）密切相关,具有统计学意义。全组患者放疗后达到病理完全缓解（PCR）的有23例（17.69%）,按TRG分级将TRG1+2分为近期疗效良好组,TRG3+4分为近期疗效不佳组进行统计分析差异具有统计学意义（p<0.0317）,即AURKA高表达患者放射治疗疗效相对较差。同时对其他可能与近期疗效相关的因素进行分析显示T分期较晚（p<0.0211）和术前有淋巴结转移（p<0.0173）近期疗效不佳。全组患者1、2年RFS分别为90.70%和82.17%;1、2年OS分别是和98.44%和89.84%。对RFS进行生存分析,单因素分析显示极光激酶A表达水平（p<0.014）、TRG分级（p<0.028）,术后淋巴结转移（p<0.008）和中性粒细胞-淋巴细胞比值（NLR）（p<0.042）影响无复发生存。将单因素分析有意义的指标纳入Cox回归多因素分析,结果显示AURKA表达水平和术后淋巴结转移情况是RFS的独立预后因素。极光激酶A表达情况对复发转移预后的相对危险度为2.766,表明极光激酶A高表达的复发转移风险是低表达患者的2.766倍。术后淋巴结转移情况对复发转移预后的相对危险度为2.153,表明术后淋巴结转移阳性（yp N+）的患者的复发转移风险是阴性患者的2.153倍。2、沉默AURKA基因表达后增强结肠癌细胞对放射治疗的敏感性我们采用通过CCK8法检测HCT116-shR-A和HT-29-shR-A细胞的增殖能力,结果显示下调AURKA的HCT116-shR-A和HT-29-shR-A细胞较亲本细胞HCT116、HCT116-NC和HT-29、HT-29-NC的增值活性明显下降（p<0.05）。同时,采用克隆形成实验,多靶单击模型拟合出细胞存活曲线,并计算相关放射生物学参数。HCT116-shR-A和HT-29-shR-A细胞的D0值分别为2.047和1.891,较对应HCT116-NC和HT-29-NC细胞的3.246和2.205下降,由此而计算的SER分别为1.166和1.585。并且准阈剂量Dq也明显降低,表明下调AURKA表达的HCT116-shR-A和HT-29-shR-A细胞放射敏感性明显升高。3、下调AURKA表达抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力细胞划痕愈合实验显示:与空白对照及空载病毒组细胞相比,下调AURKA的HCT116-shR-A和HT-29-shR-A细胞划痕愈合速度明显下降,差异具有统计学意义（p<0.05）。可见,下调AURKA表达可以显著降低HCT116和HT-29细胞的迁移能力。同时,采用Transwell实验检测下调AURKA后结肠癌细胞侵袭能力的变化,研究结果显示HCT116-shR-AURKA和HT-29-shR-AURKA细胞较HCT116、HCT116-NC和HT-29、HT-29-NC细胞进入到下室的细胞数明显减少,说明下调AURKA表达后细胞侵袭能力下降（p<0.01）。4、下调AURKA表达水平增强电离辐射诱导HCT116和HT-29细胞的凋亡基于细胞凋亡实验考察AURKA表达对电离辐射诱导条件下HCT116和HT-29细胞凋亡的影响,采用Annexin V-PE/7AAD凋亡检测试剂盒检测细胞的凋亡情况。实验结果显示HCT116-shR-AURKA和HT-29-shR-AURKA细胞较HCT116-sh Control和HT-29-sh Control细胞在电离辐射诱导条件下发生早期凋亡和晚期凋亡的细胞数均明显增多,表明细胞凋亡水平增加。以上结果说明,下调AURKA表达水平能促进电离辐射诱导的HCT116和HT-29细胞的凋亡能力（p<0.05）5、下调AURKA表达对电离辐射诱导条件下HCT116和HT-29细胞周期分布的影响采用细胞周期检测试剂盒检测下调AURKA后对电离辐射诱导条件下HCT116和HT-29细胞周期的影响,使用流式细胞仪检测细胞的周期分布。实验结果显示HCT116-shR-A和HT-29-shR-A细胞较亲本细胞HCT116-sh Control和HT-29-sh Control在电离辐射诱导情况下增加细胞G2/M期阻滞。结果说明下调AURKA表达水平促进电离辐射诱导的HCT116和HT-29细胞阻滞于G2/M期,从而抑制细胞的有丝分裂。6、下调AURKA表达水平对凋亡通路的影响通过上述的实验结果,我们已经明确AURKA在电离辐射诱导的结肠癌细胞的生物学功能方面的重要作用。在此,我们将揭示AURKA影响电离辐射诱导的结肠癌细胞的分子机制。我们的研究结果发现,靶向敲除AURKA后结肠癌细胞对电离辐射诱导较单独电离辐射（4Gy）处理组或AURKA抑制组,cleaved PARP及Bim水平显著增加,结果提示靶向抑制AURKA能增强电离辐射诱导结肠癌细胞凋亡。7、下调AURKA表达水平对c-Myc信号传导通路的影响我们的实验结果表明,敲低AURKA蛋白表达水平,会降低c-Myc的蛋白表达,同时CDK1,Cyclin B1,Ac H4的蛋白水平也显著降低。AURKA和Myc可以形成AURKA-c-Myc反馈回路,抑制AURKA可降低c-Myc直接和间接介导靶基因的表达。c-Myc可以通过TIP60/MOF介导的Ac H4调控cyclin B1和CDK1依赖性的G2/M细胞周期。处于G2/M期的细胞对辐射敏感,是影响放射敏感性的主要因素之一。因此AURKA可能通过靶向c-Myc作用于CDK1/cyclin B1信号通路进而参与G2/M细胞周期的调控。结论:1、AURKA表达水平与直肠癌患者的放射治疗敏感性和不良预后密切相关,高AURKA表达患者的放疗敏感性低且放射治疗的预后较差。AURKA表达水平可作为直肠癌患者放射治疗的独立预后因素。2、下调AURKA表达能显著增强结肠癌细胞的放射敏感性,抑制癌细胞的迁移与侵袭能力。3、下调AURKA蛋白表达协同放射增强Bim和cleaved PARP表达,增加电离辐射诱导的结直肠癌细胞凋亡能力。4、下调AURKA通过降低c-Myc表达,抑制CDK1/cyclin B1信号传导通路,阻滞细胞周期于G2/M期,从而增强结肠癌细胞HT-29及HCT116的放射敏感性。